重症肌无力单链抗体A 7基因在毕赤酵母中的表达

【摘要】  ［目的］ 将抗乙酰胆碱受体单链抗体（ScFv）A 7基因转化至毕赤酵母GS 115，筛选阳性转化子并诱导蛋白表达，制备单链抗体A 7蛋白. ［方法］ 将构建的含有抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因的重组真核表达载体pPIC 9 K-ScFv A 7经Sal Ⅰ酶切线性化后，利用电转化方法转化受体毕赤酵母菌GS 115，以甲醇诱导蛋白表达，应用鼠抗c-myc单克隆抗体进行斑点杂交试验,检查所表达的单链抗体A 7蛋白. ［结果］ 在酵母菌的培养上清液中发现单链抗体A 7蛋白的表达，而阴性对照菌中未见表达产物. ［结论］ 抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7蛋白已成功地在真核表达系统中表达.

【关键词】  重症肌无力；抗体；毕赤酵母；基因表达

    ABSTRACT: OBJECTIVE To  transform  single  chain  variable  fragment  (ScFv)  A 7  against  acetylcholine  receptor  in  myasthenia  gravis  into  Pichia  yeast  and  to  express  the  protein  in  the  eukaryotic  expression  system. METHODS The  recombinant  vector,  which  was  isolated  and  purified  from  E  coli  DH 5 α  was  linerized  by  endonuclease  Sal  Ⅰ  and  was  transformed  into  Pichia  pastoris  GS 115  by  electroporation.  The  genome  of  GS 115  was  isolated  to  conduct  the  insertion  condition  of  the  target  gene.  The  target  gene  was  induced  to  express  by  methanol.  The  expressed  products  were  detected  by  dot  blotting  assay  using  a  mouse  anti-c-myc  monoclonal  antibody.  RESULTS ScFv A 7  gene  was  inserted  into  the  chromosome  of  GS 115  successfully  and  ScFv  A 7  proteins  were  found  in  the  supernatant  after  120  hours  methanol  induction. CONCLUSION The  ScFv A 7  protein  has  been  expressed  successfully  in  the  eukaryotic  expression  system.  These  lay  a  foundation  for  the  activity  and  specificity  identification  of  this  protein.

    Key words:myasthenia  gravis;antibodies;pichia;gene  expression

    重症肌无力是抗乙酰胆碱受体抗体介导的主要累及神经肌肉接头处突触后膜上乙酰胆碱受体的器官特异性自身免疫病,目前本病主要采用非特异性免疫治疗，特异性免疫治疗仅处于动物实验阶段.由致病性抗体制备的单链抗体（single  chain  variable  fragment,  ScFv）与乙酰胆碱受体的主要免疫原区结合后可特异性地封闭致病性抗体的结合位点，阻止乙酰胆碱受体发生抗原调变，同时由于单链抗体无可结晶片段（Fc段），无法激活补体，从而起到保护作用［1］.单链抗体分子质量小，易穿过血管壁进入组织，且易进行基因操作，故近年来备受重视.希腊巴斯德研究所制备的3株鼠源性和1株人源性单链抗体［2～4］均已被证实对乙酰胆碱受体有保护作用.抗乙酰胆碱受体单克隆抗体A 7蛋白为高致病性抗体［5］，由它制备得到的单链抗体A 7蛋白仍保持与乙酰胆碱受体有较高的结合活性，并可阻碍致病性抗体对乙酰胆碱受体的攻击.巴斯德毕赤酵母表达系统是近年来广泛应用于表达外源基因的系统,具有真核细胞和原核细胞的双重特点，既可对外源蛋白进行适当加工及修饰，使目的蛋白的抗原性、免疫原性及活性与天然蛋白接近，也可将外源蛋白以可溶形式分泌到培养基中，使纯化变得简单，还可在简单的培养基中迅速生长，从而得到大量的有活性的目的蛋白.本实验旨在将克隆至真核载体pPIC 9 K上的单链抗体A 7基因电转化至毕赤酵母GS 115中,并进行诱导表达，以获取单链抗体A 7蛋白，为重症肌无力的基因治疗研究奠定基础.

    1  材料与方法

    1.1  菌种与载体  大肠杆菌DH 5 α由荷兰马斯特里赫特大学医学院神经学系神经免疫学实验室提供;载体质粒pPIC 9 K和毕赤酵母菌GS 115由军事医学院输血研究所章金刚教授惠赠;真核表达载体pPIC 9 K-ScFv A 7由延边大学免疫学与病原生物学教研部实验室构建.

    1.2  试剂  试剂盒Wizard  Plus  Minipreps  Purification  System和Wizard  DNA  Clean-up  System为美国Promega公司产品;限制性核酸内切酶Sal  Ⅰ为美国NEB公司产品;山梨醇为美国SIGMA公司产品，酵母无氨基酸氮源（YNB）和生物素为华美生物工程公司产品;鼠抗c-myc单克隆抗体为Santa  Cruz公司产品;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体和二氨基联苯氨染色液为北京鼎国公司产品.

    1.3  真核表达载体pPIC 9 K  -ScFv A 7的构建  应用PCR技术，从重组质粒pHEN 2-ScFv A 7上扩增出单链抗体A 7基因，经EcoR  I和Avr  Ⅱ双酶切纯化后与经同样酶切并纯化的真核表达载体pPIC 9 K连接，构建重组表达载体pPIC 9 K-ScFv A 7基因，将重组载体转化至大肠杆菌DH 5 α进行扩增，经酶切鉴定及序列测定证实为pHEN 2-ScFv A 7基因的构建成功.

    1.4  酵母的转化

    1.4.1  酵母感受态细胞的制备  取100 μL冻存于-80 ℃的GS 115菌株接种于3 mL新鲜YPD培养基中，置于30 ℃恒温振动培养箱内,在270 r/min条件下过夜培养，在新鲜YPD平板上划线，30 ℃培养2 d至单菌落出现;挑取酵母单菌落接种于5 mL YPD培养基中，于30 ℃，270 r/min条件下过夜培养;取出100~500 μL培养物接种于含有500 mL YPD培养基的2 L烧瓶中，于30 ℃，270 r/min条件下扩大培养至OD600值为1.2左右;于4 ℃，1 500 r/min条件下离心5 min收集菌体细胞，并用500 mL冰预冷无菌水重悬菌体细胞;于4 ℃，1 500 r/min条件下离心5 min收集菌体细胞，再用250 mL冰预冷无菌水重悬菌体细胞;于4 ℃，1 500 r/min条件下离心5 min收集菌体细胞，再用冰预冷的1 mol/L山梨醇20 mL重悬菌体细胞;于4 ℃，1 500 r/min离心5 min收集菌体细胞，再用冰预冷的1 mol/L山梨醇1 mL重悬菌体细胞，终体积约为1.5 mL;将此感受态细胞分装，每份为80 μL，于-80 ℃冻存备用.

    1.4.2  酵母的转化及鉴定  从大肠杆菌DH 5 α中提取重组载体pPIC 9 K -ScFv A 7基因，应用Wizard Plus Minipreps Purification System进行纯化，使用Sal Ⅰ酶切质粒pPIC 9 K-ScFv A 7基因使之线性化,利用电穿孔仪电转化酵母GS 115感受态细胞.电转化完成后立即使用冰预冷的山梨醇回收细胞，混匀后转入1.5 mL离心管中，30 ℃培养2,3 h,涂布于MD平板培养基中，30 ℃培养至转化子出现.待平板上的菌落长到肉眼可见时，直接将菌落置于沸水中煮10 min，离心,取上清液制作模板,将剩余的PCR反应液组分准备好,使用载体pPIC 9 K上的引物进行PCR扩增,反应条件如下:94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，30个循环；72 ℃ 10 min.

    1.4.3  转化子的筛选  将已经挑选出的阳性菌株接种到含有不同质量浓度G 418的YPD培养基平板上,置于恒温箱内,30 ℃培养4~6 d.收获培养菌，在质量浓度为4 g/L的G 418平板上获得高拷贝数的阳性转化子.

 

   1.5  重组表达载体pPIC 9 K -ScFv A 7基因在酵母菌中的表达  挑取阳性转化子的单菌落接种于3 mL BMGY液体培养基中，于30 ℃，270 r/min条件下培养过夜;取50 μL过夜培养物接种于20 mL BMGY液体培养基中,于30 ℃，270 r/min条件下培养至OD600值为2~6(对数生长期，大约16~8 h).于30 ℃,3 000 r/min条件下离心5 min，弃去上清液，用BMMY重悬细胞至OD600值为1.0左右,置于500 mL三角瓶中，以3层灭菌纱布封口，于30 ℃，270 r/min条件下振动培养,每24 h添加纯甲醇至终浓度为5~10 mL/L.在0,12,24,48,72,96,120 h时各点样1 mL，以最大转速离心5 min ,取上清液测定OD280值,并置于-80 ℃冻存备用.

    1.6  表达产物的检测  采用斑点杂交试验.取80 μL蛋白样品滴加到硝酸纤维素膜上，放入恒温箱内,待样品完全渗入到硝酸纤维素膜后,将硝酸纤维素膜置入盛有100 mL PBS-20 g/L脱脂干奶的染缸中，室温封闭振动反应1 h.弃掉90 mL反应液，加入30 mL鼠抗c-myc单克隆抗体（1∶1 000稀释），室温振动反应1 h,用PBS-0.5 g/L 吐温-20洗涤3次，再用PBS洗涤2次，每次室温振动反应5 min.加入30 mL羊抗鼠IgG HRP(1∶5 000稀释)，室温振动反应1 h,用PBS-0.5 g/L  吐温-20洗涤3次，用PBS洗涤2次.加入底物二氨基联苯氨溶液1 mL，室温振动反应30 min,见到褐色点的阳性结果出现时倒掉底物溶液，用去离子水冲洗5~10次，将硝酸纤维素膜取出，用滤纸吸干.

    2  结果

    经PCR鉴定构建的含有单链抗体A 7基因的重组载体pPIC 9 K -ScFv A 7,可见已经成功地整合至酵母菌GS 115（Fig 1）.斑点杂交试验检查结果表明，仅在甲醇诱导的含有单链抗体A 7基因的酵母菌培养上清液中可见单链抗体A 7基因的表达，120 h时表达量最多,而在阴性对照酵母菌培养上清液中则未见单链抗体A 7基因的表达（Fig 2）.

    Lane 1:marker; Lane 2:PCR products amplified from the genome  DNA of GS 115; Lane 3:plasmid pPIC 9 K;Lane 4～7:PCR products amplified from the genome DNA of GS 115/pPIC 9 K-ScFv A 7

    Fig  1  Agarose gel electrophoresis analysis of PCR detection of recombinant vector after electroporated into GS 115Lane 1:supernatant of GS 115/pPIC 9 K 120 hours methanol  induction;Lane 2:24 hours;  Lane 3:48 hours;  Lane 4:72 hours;  Lane 5:96 hours; Lane 6:120 hours

    Fig 2  Detection of protein in supernatant of GS 115/pPIC 9 K-ScFv A 7 after methanol induction in nitrocellulose dot blot assay

    3  讨论

    单链抗体是目前研究报道中最多见的小分子质量的抗体，多种表达系统适合其表达.本实验室已经在原核表达系统大肠杆菌中表达出了单链抗体A 7蛋白，但原核系统不能表达结构复杂的蛋白质,无法对翻译后的真核蛋白进行正确的修饰,且易形成包涵体，限制了其应用.巴斯德毕赤酵母具有蛋白折叠和翻译后修饰的作用，且生长迅速，培养条件简单，较其他真核表达系统更容易操作，表达量更多［6］.本实验采用单交换电转化方法，利用内切酶SalⅠ将重组载体pPIC 9 K-ScFv A 7线性化后插入到GS 115染色体上，保留了AOX1基因，故所得到的转化子表型为Mut+型.因pPIC 9 K携带有1个卡那霉素抗性基因，故成功地导入pPIC 9 K-ScFv A 7的酵母转化子可耐受G 418，整合到酵母基因组的重组质粒拷贝数越多，对G 418的抗性越强，因此本实验应用含有不同质量浓度G 418的YPD平板来筛选不同拷贝数的转化子［7］，最终在质量浓度为4 g/ L的G 418平板上获得了高拷贝数的表达菌株.已有研究结果表明，外源基因多拷贝转化子表达量高于单拷贝转化子，本实验利用限制性内切酶SalⅠ对目的基因进行了酶切线性化处理，整合到酵母染色体时多发生单交换整合，得到多拷贝数的表达株，并根据阳性转化子耐G 418的强弱筛选出高拷贝数的表达菌株以提高表达产量.毕赤酵母的培养温度一般不宜超过30 ℃，并且要求保证高通气量.酵母菌株的生物量是影响外源基因表达量的重要因素，本实验采用的培养基BMGY和BMMY既含有PBS又含有蛋白胨和酵母提取物，酵母在这些培养基中生长良好，提高了酵母的生物量.PBS可调节培养基的pH值，从而抑制蛋白水解酶的活性，防止目的蛋白的降解；蛋白胨和酵母提取物含有氨基酸和酪蛋白水解物，可为酵母细胞膜上蛋白水解酶提供足够的底物，减少其对目的蛋白的降解.本实验先采用BMGY培养基培养酵母表达株，使其蓄积生长达到一定程度，一般是OD600值达到2.0左右后，用BMMY诱导表达，保证最大通气量，每24 h添加甲醇至终浓度为5~10 mL/L,通过最终对蛋白的检测可知，诱导时间为120 h时蛋白表达量达到最大值.总之,通过本实验已成功地将单链抗体A 7蛋白完整地表达在毕赤酵母菌中,为重症肌无力的基因研究提供实验依据.

【】
  ［1］ Park SS, Ryu CJ, Kang YJ, et al..Generation and characterization of a novel tetravalent bispecific antibody that binds to hepatitis B virus surface antigens［J］.Mol Immunol,2000,37(18):1 123.

［2］ Meng F, Stassen MH, Schillberg S, et al..Construction and characterization of a single-chain antibody fragment derived from thymus of a patient with myasthenia gravis［J］.Autoimmunity,2002,35(2):125.

［3］ Holliger P, Prospero T, Winter G, et al..“Diabodies”:small bivalent and bispecific antibody fragments［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(14):6 444.

［4］ Zhu Z, Zapata G, Shalaby R, et al..High level secretion of a humanized bispecific diabody from Escherichia coli［J］.Nature Biotechnology,1996,14(2):192.

［5］ 金桂花,王玉祥,范华英,等.重症肌无力乙酰胆碱受体单链抗体基因的构建［J］.延边大学医学学报,2004,27(3):162.

［6］ Cereghion JL, Cregg JM. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris［J］.FEMS Microbiology Reviews,2000,24(1):45.

［7］ Scorer CA, Clare JJ, Mccombie WR, et al..Rapid selection using G 418 of high copy number transformants of Pichia Pastoris of high level foreign gene expression［J］.Bio Technology,1994,12(2):181.