刺五加注射液对Hela细胞抑制作用的实验研究

【摘要】  目的：探讨刺五加注射液对人宫颈癌细胞株Hela体外增殖的抑制作用。方法：采用MTT法测定了不同浓度的刺五加注射液对人宫颈癌细胞株Hela的体外抑制作用，倒置显微镜观察细胞形态变化。结果：刺五加注射液浓度越高对Hela细胞抑制作用越好，作用时间越长抑制效果越强，量效关系和时效关系良好；形态学观察到细胞凋亡。结论：刺五加注射液对人宫颈癌细胞株Hela的细胞增殖有较强的抑制作用。

【关键词】  刺五加；宫颈肿瘤；Hela细胞；细胞凋亡

  【ABSTRACT】  Objective:To study the inhibitory action of Acanthopanax injection on human cervical cancer cells for Hela growth.Methods:MTT assay was used to determine the human cervical cancer cells for Hela growth and inhibitory rates with various concentrations of Acanthopanax injection,then the changes of cells? shape with upside-down microscope(was observed).Results:The higher concentration of Acanthopanax injection was,the stronger inhibitory function to Hela was.The inhibitory effect was observed stronger with the concentration increasing and time prolonging.Morphological observation showed cell apoptosis.Conclusion:Acanthopanax injection has stronger inhibitory function on the growth of tumor cells Hela.

    【KEY WORDS】  ACANTHOPANAX SENTICOSUS;Uterine Cervical Neoplasms;Hela cells;Apoptosis

    在世界范围内，宫颈癌(cervical cancer)是妇女第二大常见恶性肿瘤。在一些家，是妇女的头号死因。目前临床主要采取手术和放化疗，此外中西医结合法也是普遍采用的方案。中医治疗肿瘤具体法则很多，由于肿瘤患者绝大多数属本虚标实之候，故采用扶正培本法相对较多。扶正培本法的目的主要在于抑癌抗癌、提高机体免疫力、减轻放化疗的毒副作用等。常用中药有灵芝、天花粉、枸杞、黄芪、党参、人参、刺五加、鳖甲等。刺五加的化学成分复杂，主要活性成分为刺五加苷和刺五加多糖，《神农本草经》把五加类药物列为上品，有“补中、益精、坚筋骨、强意志”的功效［1，2］；而医学研究表明刺五加具有扩张血管、抗疲劳、抗应激、抗炎的作用，有利于组织的修复［3，4］。笔者测定了4种不同剂量的刺五加注射液对人宫颈癌细胞株Hela的抑制作用，探讨其量效关系和时效关系，为刺五加抗肿瘤的深入研究及今后的临床应用提供依据。

    1  材料和方法

    1.1  材料  刺五加注射液（黑龙江省完达山制药厂，国药准字Z23020810）；人宫颈癌细胞株Hela，由河北农业大学生命院提供。

    1.2  仪器和试剂  CO2培养箱（美国SHELDON公司）；净化工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；酶标仪（郑州博塞生物工程公司）；倒置显微镜（上海光学仪器五厂）；96孔培养板（美国Costar公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；DMEM培养液和胰蛋白酶（GIBCO公司）；顺铂（齐鲁制药有限公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司）。

    1.3  方法

    1.3.1  细胞培养  将Hela细胞贴壁生长于DMEM完全培养液体系（含10% 胎牛血清，青霉素和链霉素各100U/mL），置于37℃，饱和湿度，5%CO2的培养箱中进行培养，待细胞长至对数生长期时用DMEM完全培养基将细胞浓度调整为1×105 个/mL的细胞悬液待用。

    1.3.2  MTT法检测刺五加注射液对Hela细胞增殖的抑制作用  按1×105 个/mL的细胞密度将Hela细胞接种到96孔培养板中，终体积为每孔200μL，分组加入相应药物，空白对照组加生理盐水，实验组加入不同剂量的刺五加注射液，分别为每孔10μL，20μL，40μL，80μL，并设4个平行孔，分别培养24ｈ、48ｈ和72ｈ后加入MTT液（5μg/μL）20μL，继续培养4ｈ，弃上清液，加入二甲亚砜（DMSO）每孔150μL，震荡15min，测定吸光度值（OD值），测定波长λ=570nm，参考波长λ=630nm，抑制率（Grow inhibitory rate,GIR）：

    抑制率（%）=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100%

    1.3.3  形态学观察  取对数生长期的Hela细胞接种于48孔细胞培养板内，培养24 h，实验组每孔加入20 μL的刺五加注射液，对照组加入生理盐水，培养48 h后在倒置显微镜下观察细胞的形态变化。

    2.1  对Hela细胞增殖的抑制作用

    2.1.1  刺五加注射液对Hela细胞抑制作用的量效关系  Hela细胞经不同剂量的刺五加注射液处理48h后，代谢MTT的能力明显下降，均显示较明显的细胞毒性反应，且随着药物浓度的降低，抑制率逐渐降低，剂量效应关系显著，试验组效果明显优于阴性对照组（P<0.05）（表1）。

    2.1.2  刺五加注射液对Hela细胞抑制作用的时效关系  4种不同剂量的刺五加注射液作用于Hela细胞24、48、72h，随着作用时间的延长，抑制作用明显增强，具有良好的时效关系（表2）。

    2.2  形态学观察  对照组宫颈癌Hela细胞呈扁平的不规则长梭形或多角形，核圆形，位于中央，排列无方向性，细胞边缘清楚，培养基内悬浮的细胞和碎片少；实验组刺五加注射液作用Hela细胞，胞膜起皱，细胞呈圆形，细胞膜完整，培养基内悬浮的细胞和碎片多。表1  不同剂量的刺五加注射液对Hela细胞增殖的抑制作用（略 ）表2  刺五加注射液不同作用时间对Hela细胞的抑制率（略 ）

    3  讨论

    扶正培本类中药主要通过增强或调节机体免疫功能，升高外周白细胞数，促进网状内皮系统的吞噬功能，提高具有细胞毒的T淋巴细胞攻击能力，使癌细胞失去转移能力而崩解。中药刺五加(Radixet Caulis Acanthopanacis Senticosi)又名五加参，为五加科植物刺五加的根和茎。刺五加注射液为其经水醇法提取制成的灭菌制剂，含黄酮、刺五加多糖和刺五加苷等多种有效成分，广泛用于临床多种疾病的［5，6］。近年来刺五加在抗肿瘤方面的研究也取得了一定的进展，刺五加的提取物对肺癌、胃癌、艾氏腹水癌及白血病等多种肿瘤均有较强的抑制作用，还可改善肺肿瘤化疗患者的免疫状况，提高机体的抗肿瘤效应［7，8］。上述试验资料表明，刺五加注射液可抑制体外宫颈癌Hela细胞的生长繁殖，随着给药剂量的增加，抑制作用增强，显示出良好的剂量效应关系，与阴性对照组比较具有显著性差异（P<0.05）；同时刺五加注射液对Hela细胞的抑制作用还体现出良好的时间效应关系，在同一给药剂量下，随着给药时间的延长，细胞抑制作用愈加明显。刺五加中含有的多糖及苷类从不同方面参与抗肿瘤作用的形成，至于其抗肿瘤详细作用机理还有待于今后进一步研究。

【】
  1 王峻，何嘉言，孙宏高,等.刺五加注射液对肺肿瘤化疗患者免疫调节作用的研究［J］.浙江中西医结合杂志，2001，11(6):339

2 张旭东，马杰，张彬.刺五加的药理作用研究概况［J］.河北中医药学报，2007，22(3):45-46

3 张祎，刘宝珠，裴月湖.刺五加药理作用研究进展［J］.沈阳药科大学学报，2002，19(2):143-146

4 韩玉英，丰平，文朝阳.抗癌中草药研究进展［J］.北京中医杂志，2003，22(2):45-48

5 范丽静，蒋晓红，姚国恩.刺五加注射液的研究进展［J］.中成药，2003，25(6):488-490

6 杜秀芳，刘伟娜，詹文红.刺五加注射液的临床应用进展［J］.中西医结合杂志，2007，16(24):3603-3604.

7 黄浏姣，赵刚.三氧化二砷与刺五加合用诱导Hela细胞凋亡的实验研究［J］.时珍国医国药，2006，17(11):2193-2194

8 张松，王留兴，樊青霞,等.刺五加叶皂苷联合冬凌草甲素对人食管癌Eca-109细胞的生长抑制作用［J］.肿瘤基础与临床，2007，20(3):226-229