Survivin和COX-2在膀胱移行细胞癌中的表达

【摘要】  目的 探讨Survivin和COX-2在人膀胱移行细胞癌(BTCC)中的表达及其临床意义。方法 采用S-P免疫组化技术分别观察40例BTCC和10例正常膀胱组织标本中Survivin和COX-2的表达，分析其表达水平与BTCC临床病理参数之间的关系。结果 Survivin和COX-2基因在BTCC中的表达与在正常膀胱黏膜比较差异均有统计学意义(均为P＜0.01)。不同临床分期和病理分级间Survivin和COX-2表达的差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。结论 Survivin和COX-2的高表达是BTCC预后不良的指征，有望成为BTCC预后不良的独立性指标。

【关键词】  移行膀胱癌；Survivin；COX-2

　
　　Abstract: Objective  To explore the expression of Survivin and COX-2 in human bladder transitional cell carcinoma(BTCC) and the biological significance. Methods  Immunohistochemical S-P method and RT-PCR、western plot was used to detect the expression of Survivin and COX-2 in 40 cases with BTCC and 10 controls with normal bladder mucosa. Results  The expression of the Survivin and COX-2 in human BTCC was higher than that in normal bladder mucosa (P＜0. 01). There was significant difference in the expression of Survivin and COX-2 among different clinical stages (P＜0.05). The significant difference in the expression of Survivin and COX-2 among the different pathological grades was found (P＜0.05 or P＜0.01). Conclusion  The high expression of Survivin and COX-2 could be regarded as an independent indication for evaluating the prognosis in BTCC.

　　Key words: bladder neoplasms；survivin；COX-2

    膀胱移行细胞癌(BTCC)的浸润和转移进程复杂，与多种癌基因和抑癌基因的表达、调控以及细胞凋亡有关。Survivin 基因是近年来发现的凋亡抑制基因；COX-2基因是与抑制肿瘤转移相关的基因，它们对多种肿瘤的转移有调控作用。本研究应用SP 免疫组化方法和RT-PCR检测了40例膀胱癌和10例正常膀胱组织标本的Survivin和COX-2的表达，探讨其表达与BTCC临床分期、病理分级的相互关系，为临床正确估计预后和提供依据。

　　1  材料与方法

　　1．1  研究对象

    宁夏医学院附属泌尿外科2006年1月—2006年12月电切和开放手术治疗的BTCC患者40 例，其中男20例，女20例，年龄31～80岁，平均62岁。经尿道膀胱肿瘤电切(TURBt)20例，膀胱部分切除10例，膀胱全切10例。病理分级按WHO法，其中G1级15例，G2 级15例，G3 级10例；肿瘤分期按UICC TNM 标准，其中T1 期12例，T2期15例，T3期13例。组织学分类：40例均为BTCC。从10例行开放手术的前列腺增生(BPH)患者取膀胱组织标本作对照。

　　1．2  染色方法

    所有标本均经10%的多聚甲醛固定、石蜡包埋并进行连续超薄切片，分别作苏木精2伊红(HE)染色、免疫组织化学SP染色。所有标本均由两位病专家确诊。所有一抗均购自Maixin公司，SP试剂盒由福州迈新生物技术开发有限公司提供。所有操作严格按试剂盒说明进行。石蜡切片脱蜡，水化后行免疫组织化学染色。抗体工作浓度Survivin为1∶100，COX-2为1∶200，最后用二氨基联苯氨(DAB)染色，苏木精复染。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，已知阳性标本作为阳性对照，阳性标本显色后，立即全部终止反应。

　　1.3  结果判断

    Survivin、COX-2阳性表达为胞浆成棕黄色。在切片阳性细胞区随机挑选10个高倍视野共计数1000个肿瘤细胞，按照［1］方法，在高倍镜下对染色作如下评分：①染色深浅：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；②染色细胞计数：没有细胞染色为0分，1%～10%为1分，11 %～33 %为2分，34 %～66 %为3分，＞66 %为4分。两项结果相加＜2分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性(6)，6～7分为强阳性(7)。

　　1.4  RT-PCR检测Survivin、COX-2 mRNA的表达

    分别收集培养的各组细胞，按Trizol试剂盒说明书提取总RNA，取1μg总RNA反转录合成cDNA，再取20μL反转录产物进行PCR循环。Survivin引物序列：上游5′-ACAACCAAACCTCACACTACTG-3′，下游5′-ATAGATCCCATTACAGACAGCG-3′。COX-2引物序列：上游5′- GGATTTTTATTTAAGAGGAGTAGGT -3′，下游5′-CTACCAAAATTTTTATTATAATCCC -3′。Survivin产物长度439bp，COX-2产物长度468bp，94℃变性1min，60℃复性30s，72℃延伸40s，共35个循环，末次循环72℃延伸10 min。GAPDH引物序列：上游5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′，下游5′-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3′，产物长度648bp，94℃变性1 min，55℃复性30s，72℃延伸40s，共30个循环，末次循环72℃延伸10min。反应结束后取反应产物5μL进行20g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，UVP型凝胶图像分析系统做图，以各组目的基因与GAPDH基因灰度的比值代表Survivin、COX-2 mRNA的表达量。

　　1.5  数据分析

    各样本测定值以平均值±标准差表示，以统计学软件SPSS 11.0进行分析，采用Fisher确切概率法检验分析Survivin和COX-2在膀胱癌组及正常组织中表达的关系；采用R×C列联表扩检验分析BTCC组织中survivin和COX-2的表达与其临床病理特征之间的关系；采用Pearosn相关性检验分析BTCC组织中Survivin和COX-2表达之间的相关性。以a=0.05作为统计学检验的显著性水准。

　　2.1  BTCC及对照膀胱组织中Survivin、COX-2蛋白表达

    对照膀胱组织中Survivin、COX-2均无阳性表达，在BTCC中Survivin为胞浆和胞核成棕黄色(图1，见封4)，COX-2为细胞胞浆和胞膜染成棕黄色(图2，见封4)。

    Survivin、COX-2在40例BTCC组织中阳性表达分别为29例(72.5 %)、26例(65.0 %)，在10例正常膀胱组织中为0例，两者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。在不同临床分期中Survivin、COX-2表达差异均有统计学意义(P＜0.05)；在不同病理分级中阳性表达差异均有统计学意义(P＜0.05 或P＜0.01)，见表1。表1  Survivin 、COX-2在 BTCC中的表达（略）

　　2.2  Survivin、COX-2 mRNA表达

    以各组目的基因与GAPDH基因灰度的比值代表Survivin mRNA的表达量。BTCC组织内Survivin、COX-2 mRNA表达均显著增加，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。表2  BTCC组织Survivin、COX-2表达量（略）

　　3  讨论

    Survivin 是新近发现的一种细胞凋亡抑制蛋白，它具有抑制细胞凋亡与调节细胞周期两种功能，在大多数恶性肿瘤中都有表达，而在除胚胎期外的正常组织中不表达［2］。Survivin 可抑制Caspase级联反应下游的Caspase3、7，发挥其抗凋亡作用［3］，其用于BTCC的诊断已引起了广泛关注。本研究发现，在40例BTCC中，Survivin的阳性表达率为72.5%，且与肿瘤的病理分级呈正相关，这与Gazzaniga等［4］研究结果一致。

    COX-2是一种膜结合的分子量为71ku的糖蛋白，具有环氧合酶和过氧化物合成酶的双重功能［5］。COX-2 在正常组织中不表达或极微量表达，但在肿瘤组织中表达量显著提高，提示与肿瘤的发生密切相关。COX-2 参与肿瘤发生的机制不明，可能与促进肿瘤血管生成和抑制机体免疫反应等有关。本研究发现，COX-2 在BTCC组织中强阳性表达，并且与肿瘤的分级、分期相关。提示COX-2 的过表达不仅促进BTCC的发生，并且可能加强了肿瘤的侵袭和转移能力，本研究结果与Lim等［6］的发现相符。Peng 等［7］和Cornetta 等［8］在对喉鳞癌和甲状腺癌的研究中也发现COX-2 mRNA 和COX-2蛋白呈高表达。Gallo 等［9］的研究表明，在头颈部肿瘤中COX-2 的表达与肿瘤血管的生成有关，同时通过Cox多元回归分析发现，COX-2 蛋白的过表达是最有意义的预后因子。

    BTCC的转移复发是一个多步骤、多因素相互作用的复杂过程，单一的分子指标是无法进行精确预测的，各种指标中均无足够的特异性，采用多个指标进行联合检测是今后的研究方向。在我们研究的2种基因中，其在染色体上的定位各不相同，Survivin 为凋亡抑制蛋白，COX-2属原癌基因，2个基因在BTCC中表达增强，也说明膀胱肿瘤的发生是一个多基因突变的结果。总之，COX-2和Survivin各自高表达或两者共同高表达均是BTCC预后不良的指征，有望成为BTCC预后不良的判断指标。

【】
  　　［1］Fromowitz FB，Voila MV，Chao S，et al.Ras p21 expression in t he procression of breast cancer［J］.Hum Pathol，1987，18(8)：1268-1671.

　　［2］Adida C，Cortty PL，Mcgrat HJ，et a1.Developenmentally regulated expression of the novel cancer anti-apoptosis gene survivin in human and mouse differentiation［J］. Am J Pathol，1998，152(8)：43-46.

　　［3］Shin S，Sung BJ，Cho YS，et al.Ananti-apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase23 and 27［J］. Biochemistry，2001，40(10)：1117-1179.

　　［4］Gazzaniga P，Gradilone A，Giuliani L，et al.Expression andprognostic significance of livin，survivin and other apoptosis-related genes in the progression of superficial bladder cancer［J］.Ann Oncol，2003，14(3)：85-88

　　［5］Xie WL，Chipman JG，Robertson DL，et al.Expression of amitogen-responsive gene encoding prostaglandin synthase isregulated by mRNA splicing［J］. Proc Natl Acad Sci USA，1991，88(7)：2692-2696.

　　［6］Lim SC，Park SY，Do NY.Correlation of cyclooxygenase pathway and VEGF expression in head and neck squamous cell carcinoma［J］. Oncol Rep，2003，10(5)：1073-1079.

　　［7］Peng JP，Su CY，Chang HC，et al.Overexpression of cyclooxygenase22 in squamous cell carcinoma of the hypopharynx［J］. Hum Pathol，2002，33(1)：100-104.

　　［8］Cornetta AJ，Russell JP，Cunnane M，et al.Cyclooxygenase22 expression in human thyroid carcinoma and Hashimoto′s thyroiditis［J］. Laryngos-cope，2002，112(2)：238-242.

　　［9］Gallo O，Masini E，Bianchi B，et al.Prognostic significance of cyclooxygenase 22 pathway and angiogenesis in head andneck squamous cell carcinoma［J］. Hum Pathol，2002，33(7)：708-714.