重组人促红细胞生成素对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护作用
【关键词】 再灌注损伤
摘 要：［目的］观察重组人促红细胞生成素(rHuEPO)对肢体骨骼肌缺血再灌注(I／R)损伤的保护作用。［方法］建立大鼠后肢缺血再灌注模型。40只大鼠随机均分为：假手术组(Ⅰ组)，I／R组(Ⅱ组)，I／R+生理盐水组(Ⅲ组)，I／R+rHuEPO组(Ⅳ组)。取血浆测定丙二醛(MDA)、肌酸磷酸激酶(CPK)和乳酸脱氢酶(LDH)含量。取骨骼肌标本测定髓过氧化酶(MP0)活性、湿重／干重比(Wet／dry)。［结果］Ⅱ组与Ⅰ组比较，血浆和骨骼肌的各项生化指标显著增高(P＜001)；Ⅳ组血浆及骨骼肌各项测定指标较Ⅱ组相比明显降低(P＜001)。Ⅲ组和Ⅱ组之间比较，差异无显著意义。［结论］rHuEPO对肢体骨骼肌缺血再灌注损伤有保护作用。
关键词：再灌注损伤； 骨骼肌； 重组人促红细胞生成素
Protective effect of recombinant human erythropoietin on ischemia/reperfusion injury of rat skeletal muscle
Abstract：［Objective］To observe the protective effect of recombinant human erythropoietin(rHuEPO）on ischemia/reperfusion(IR）injury of skeletal muscle in the limbs of rats［Method］ After establishing the rat model of hind limb ischemia/reperfusion,forty rats were divided into 4 groups:sham operation group（Group Ⅰ),I/R group（Group Ⅱ),I/R + normal saline treatment group(Group Ⅲ),I/R + rHuEPO treatment group(Group Ⅳ)The levels of malodialdehy(MDA), creatinephosphokinase(CPK）and lactatedehpdrogesase(LDH）in plasma and myeloperoxidase(MPO）ratio,wet/dry of skeletal muscle were measured respectively［Result］The indexes of plasma and skeletal muscle in group Ⅱ were significantly higher than those in groupⅠ(P＜001),while the indexes of the group Ⅳ were significantly lower than those in group Ⅱ(P＜001)， and indexes of group Ⅲ has no difference with those of Group Ⅱ［Conclusion］The rHuEPO can protect the skeletal muscle from ischeinia/reperfusion injury in rats
Key words：Reperfusion injury; Skeletal muscles; Recombinant human erythropoietin
肢体的创伤、断肢再植、组织移植以及止血带的应用时间过长均可引起缺血再灌注(I／R)损伤。它可影响缺血组织的存活及功能，且可累及远隔器官，严重时可引发多器官功能衰竭而致病人死亡。最近研究发现促红细胞生成素(EPO)是一种多功能营养因子及保护因子，可减轻脊髓、心肌、肾脏等组织器官的I／R损伤〔1~3〕。EPO对肢体骨骼肌I／R损伤的影响，目前尚未见有报道。通过本项研究，探讨重组人促红细胞生成素（rHuEPO）对肢体骨骼肌I／R损伤的影响，为临床应用rHuEPO肢体骨骼肌I／R损伤提供一定的实验依据。
1 材料和方法
11 动物分组及处理
雄性Wistar大鼠40只，体重(250±20)g(山东大学医学院动物实验中心提供)，随机均分为4组：假手术组(Ⅰ组)，I／R组(Ⅱ组)，I／R+生理盐水组(Ⅲ组)，I／R+rHuEPO组(Ⅳ组)。动物模型制作：参照〔4〕方法制成。1％戊巴比妥钠40 mg／kg腹腔麻醉，沿左侧股鞘走行切开皮肤，在8倍手术显微镜下分离股动静脉，用无创性血管夹夹闭股动脉，股鞘下用张力带环扎左侧肢体以阻断侧支循环4 h。于再灌注前5 min，Ⅲ组尾静脉注入650μl／kg生理盐水，Ⅳ组尾静脉注入4 000IU／kg rHuEPO(日本麒麟啤酒株式会社制造，国药准字S20010076)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组于再灌注4 h，心脏采血并取左后肢腓肠肌。Ⅰ组仅切开暴露股血管，采血、取材，方法同上。
12 检测指标及方法
硫代巴比妥酸法测定血浆中丙二醛(MDA)含量，全自动生化分析仪测定血浆中肌酸磷酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)。骨骼肌组织匀浆、用MPO测试盒(南京建成生物工程研究所)测定髓过氧化酶(MPO)的活性。取腓肠肌200 mg立即测其湿重，然后于80 ℃恒温干燥箱中干燥48 h，再测干重，最后湿重／干重比(Wet／dry)。
13 统计学分析
数据结果用x-±s表示，行方差分析，均数间差别比较用LSD检验。
2 结 果
21 血浆标本测定项目的变化
缺血再灌注组恢复血流灌注4 h后，Ⅱ组MDA、CPK、和LDH的含量与Ⅰ组相比显著增高(P＜001)。以上3项指标Ⅲ组与Ⅱ组相比差异无显著意义(P＞005)。以上3项指标Ⅳ组与Ⅱ组相比降低，差异显著(P＜001)。结果见表1。表1 各组血浆MDA、CPK、LDH的变化(略)注：*Ⅱ组，Ⅲ组，Ⅳ组分别和Ⅰ组比较P＜001；△Ⅳ组和Ⅱ组比较P＜001
22 骨骼肌标本测定项目的变化
缺血再灌注组恢复血流灌注4 h后，MPO值、湿重／干重比两项指标Ⅱ组比Ⅰ组显著增高(P＜001)。Ⅲ组与Ⅱ组相比差异无显著意义(P＞005)。Ⅳ组比Ⅱ组降低，差异显著(P＜001)。结果见表2。表2 实验各组动物骨骼肌MPO、Wet／dry的变化(略)注：*Ⅱ组，Ⅲ组，Ⅳ组分别和Ⅰ组比较P＜001；△Ⅳ组和Ⅱ组比较P＜001
3 讨 论
肢体遭受一定时期的缺血，在血供完全恢复后，可出现比缺血时更为严重的损伤，即缺血再灌注(I／R)损伤。正常骨骼肌细胞内含有丰富的CPK、LDH，在缺血细胞损伤时，由于膜结构破坏，细胞内酶大量进入血液循环，故对血清中CPK、LDH含量的测量可作为肌细胞损伤程度的指征〔5〕。本实验结果显示，促红细胞生成素可明显减轻肌细胞酶的漏出，对骨骼肌I／R损伤有显著的保护作用。骨骼肌I／R损伤的发生机理比较复杂。目前普遍认为，白细胞介导的炎症反应、氧自由基、血管内皮损伤等因素在骨骼肌I／R损伤中起关键作用〔6~7〕。MDA含量反映脂质过氧化程度并间接反映自由基的多少。MPO反映中性粒细胞游出并在组织内聚积的程度，湿重／干重比反映骨骼肌组织水肿程度，与再灌注损伤时组织微血管床损伤有关〔5〕。本实验中，与假手术组相比，I／R组血浆MDA值、骨骼肌MPO值和湿重／干重比均显著性升高，与以前报道相符〔6~7〕。因此从骨骼肌I／R产生机理的不同环节进行是缓解骨骼肌缺血再灌注损伤较为理想的方法。
EPO是一种分子量约337 ku的糖蛋白，主要由肾小管间质细胞分泌。rHuEPO与天然EPO具有相同的生物学活性，与啮齿目动物EPO具有大约80％的同源性。过去认为EPO是一种仅作用于骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增生、分化、最终成熟的内分泌激素，对机体供氧状况发挥重要的调控作用。近来研究表明，体内其他组织也有EPO及其受体(EPOR)的大量表达，EPO是一种多功能营养因子及保护因子，可减轻脊髓、心肌、肾脏等组织器官的缺血再灌注(I／R)损伤〔1~3〕，其生物功能可通过与EPOR结合，引起Janus kinase2(Jak2)系统和nuclear factorкB(NFкB)系统的信号传导与活化而起作用〔8〕。本实验表明rHuEPO可显著降低骨骼肌I／R后MDA产生、抑制MPO活性和缓解组织水肿，提示rHuEPO可以从抑制白细胞介导的炎症反应、氧自由基的产生和保护血管内皮损伤多个环节发挥对骨骼肌I／R损伤的保护作用。其具体作用机理尚不十分清楚，目前研究表明：(1)多型核白细胞(PMNL)的细胞膜存在EPOR，EPO能够抑制PMNL所引发炎性反应，接受EPO治疗的病人体内致炎因子TNF减少〔9〕;(2)EPO具有血小板生长因子相似的作用，可增强超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化酶的活性，从而增强抗氧化活性，有清除氧自由基的作用〔10〕;(3)Chong等〔11〕证实EPO可阻止血管内皮损伤，其机理为保持线粒体膜稳定、直接激活蛋白激酶B／Akt和抑制半胱氨酸蛋白酶Capase8，Capase1和Capase3的活性。
肢体I／R损伤的病人日益增多。肢体的I／R损伤可导致较高的病残率，且常伴有不同程度的贫血。rHuEPO在临床上已被广泛应用于治疗贫血，临床疗效较好，副作用小且对肢体骨骼肌I／R损伤具有显著的保护作用。对其分子机理进行进一步的研究后将对临床应用、减轻肢体骨骼肌I／R损伤具有较大的实用价值。
：
〔1〕 Celik M,Gokmen N,Erbayraktar S,et al.Erythropoietin prevents motor neuron apoptosis and neurologic disability in experimental spinal cord ischemic injury［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(4):22582263.
〔2〕 Wright GL,Hanlon P,Amin K,et al.Erythropoietin receptor expression in adult rat cardiomyocytes is associated with an acute cardioprotective effect for recombinant erythropoietin during ischemiareperfusion injury［J］.FASEB J,2004,18(9):10311033.
〔3〕 Yang CW,Li C,Jung JY,et al.Preconditioning with erythropoietin protects against subsequent ischemiareperfusion injury in rat kidney［J］.FASEB J,2003,17(12):17541755.
〔4〕 冯亚高，闽坤山，邓素雅，等.缺血预处理改善骨骼肌缺血再灌注损伤的实验研究［J］.矫形外科杂志，1998，6(1)：4849.
〔5〕 蓝 旭，刘雪梅，葛宝丰，等.β七叶皂甙钠对肢体缺血再灌注损伤的保护作用［J］.中国矫形外科杂志，2000，8(6)：572573.
〔6〕 Gute DC,Ishida T,Yarimizu K,et al.Inflammatory responses to ischemia and reperfusion in skeletal muscle［J］.Mol Cell Biochem,1998,179(12):169187.
〔7〕 Menger MD,Rucker M,VollmarB.Capillary dyefunction in striated muscle ischemia/reperfusion:on the mechanisms of capillary “noreflow”［J］.Shock,1997,8(1):27.
〔8〕 Digicaylioglu M,Lipton SA.Erythropoietin mediated neuroprotection involves crosstalk between JAK2 and NYк B signaling cascades［J］.Nature,2001,412：641647.
〔9〕 Sela S,Shurtz Swirski R,Sharon R,et al.The polymorphonuclear leukocyte a new target for erythropoietin［J］.Nepbron,2001,88(3):205210.
〔10〕 SakanakaM,WenTC,Matsuda S,et al.In vivo evidence that erythropoietin protects neurons from ischemic damage［J］.Proc Natl Acad Sci,1998,95(8):46354640.
〔11〕 Chong ZZ,Kang J,Maiese K,et al.Erythropoietin is a novel vascular protectant through activation of Aktl and mitochondrial modulation of cysteine proteases［J］.Circulation,2002,106(24):29732979.
