降钙素在体内和体外实验中对兔关节炎关节软骨的保护作用
【摘要】 ［目的］研究降钙素（calcitonin，CT）对骨性关节炎关节软骨的保护作用。［方法］32只6个月龄新西兰大白兔，雌雄各半，行右膝关节前交叉韧带切断术。术后1周将动物随机分为实验组和对照组。实验组皮下注射鲑鱼降钙素5 IU／（kg·d），连续6周；对照组则给予等剂量盐水。术后7周处死动物。取股骨内髁制成切片行HE、番红-固绿和MMP-3免疫组化染色。取膝关节软骨行胶原酶消化法提取软骨细胞进行体外培养，于第Ⅱ代融合90％后提取mRNA，采用实时荧光定量PCR方法检测MMP-3，aggrecan的表达。HE切片Mankin评分。番红-固绿和MMP-3免疫组化染色切片用图像分析仪测量平均灰度值。PCR结果记录Ct值。［结果］实验组关节软骨的组织学Mankin评分结果，番红-固绿和MMP-3免疫组化染色平均灰度值测量结果低于对照组（P＜0.05）；实验组体外培养软骨细胞的MMP-3的RNA含量低于对照组（P＜0.05），aggrecan的RNA含量高于对照组（P＜0.05）。［结论］降钙素5 IU／（kg·d）皮下注射能够增加体外培养软骨细胞分泌的aggrecan的含量以及下调MMP-3的表达；可能通过体内明显减轻兔膝关节软骨基质的降解，减少MMP-3的表达而保护软骨。
【关键词】 降钙素； 骨性关节炎； 基质金属蛋白酶3； 软骨细胞
Abstract:［Objeetive］To access whether calcitonin exerts a chondroprotective action in unstable knees which induce experiment anterior cruciate ligament transaction（ACLT）on the right knee and were divided randomly into two groups-ACLT group and ACLT+CT group.ACLT+CT group began to receive a daily subcutaneous injection of salmon calcitonin at a does of 5 IU per kg of body weight for 6 weeks;in contrast,ACLT group received NS at the same does.All rabbits were killed on day 49 postoperation cartilage sections were stained with safranin-O-fast green,HE and immunostained MMP-3 antibodies.Chondrocytes expressions of MMP-3 and aggrecan were further examined by Realtime RT-PCR.［Result ］The score,the grey value of Safranin-O-fast green of ACLT+CT group were higher than ACLT group（P＜0.05）,and MMP-3 of ACLT+CT group were lower than ACLT group（P＜0.05）.In ACLT group,gene expression levels of aggrecan were lower than ACLT+CT group,and MMP-3 were higher（P＜0.05）.［Conclusion］A daily subcutaneous injection of salmon ealcitonin at a does of 5IU/kg of body weight can increase the expression levels of aggrecan of chondrocyte and decrease the expression levels of MMP-3 of chondrocyte which be cultivate in vitro.Caleitonin probably protects articular cartilage by reducing the degradation of cartilage matrix and reducing the expression levels of MMP-3 in vivo.
Key words:calcitonin; osteoarthritis; matrix metalloproteinase-3; chondrocyte
骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是老年人常见的疾病之一。其特点是进行性关节软骨丧失，新骨形成，软骨下骨小梁与生长板硬化，骨赘形成，基质降解使软骨丢失和基质修复之间失去平衡。长期以来对OA关节软骨的改变进行了较多研究，基质金属蛋白酶（matix metalloproteases，MMPs）因参与体内细胞外基质的降解，在OA关节软骨基质及软骨细胞破坏的病理过程起着重要作用而被广泛重视〔1〕。目前关于降钙素对软骨作用的研究多为单纯体内实验或者单纯体外实验。本研究在作者以往研究的基础上，采用兔不稳定膝关节诱导骨关节炎模型，用体内实验结合体外实验的方法，以软骨基质及破坏基质的酶-MMP-3为研究对象，进一步研究降钙素对关节软骨的保护作用并探讨其具体作用机理，进而为临床应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物分组与手术
健康6个月龄新西兰大白兔32只，雌雄各半（购自北京维通利华公司，批号：SCXK京，2002-2007）。随机分为两组，行右膝关节前交叉韧带切断术（anterior cruciate ligament transaction，ACLT）。
1.2 给药方法
ACLT+CT（calcitonin）组每日1次皮下注射降钙素（瑞士诺华制药北京公司）5 IU／kg，ACLT组给予等剂量生理盐水皮下注射；ACLT组左膝关节作为空白对照组与右膝关节对照以确定造模成功，ACLT组和ACLT+CT组右膝关节对比确定降钙素对关节软骨的作用。
1.3 标本采集和处理
动物处死后，立即解剖膝关节。ACLT+CT组和ACLT组分别8只动物，切下股骨髁置于4％多聚甲醛中固定，15％EDTA-2Na溶液脱钙，石蜡包埋，沿正中矢状面作4 μm连续切片。行HE染色，番红-固绿（safranin“O”and fast-green）染色，MMP-3免疫组化染色。另外ACLT+CT组和ACLT组各8只动物在无菌环境下用手术刀片切取膝关节面软骨，严格去除其他组织。于超净台内剪成1 mm×1 mm×1 mm的碎片后用0.2％Ⅱ型胶原酶37 ℃水浴震荡7 h，2 000r/min离心10 min后弃去上层液体，加单纯培养基吹打后用2 000目筛网过滤，2 000r/min离心；弃上层液体，加入10 ml完全培养基吹打后计数，以105密度接种于35 mm2培养瓶，放于37 ℃CO2培养箱培养。于第Ⅱ代融合90％后提取mRNA，Realtime-PCR法检测MMP-3，aggrecan的表达。
1.4 免疫组织化学
4 μm连续切片，平铺于多聚赖氨酸包被的载玻片上，烤片12 h，常规脱蜡至水。3％过氧化氢浸泡15 min，复合酶37 ℃修复30 min。滴加抗兔MMP-3多克隆抗体（购自天津灏洋），4 ℃湿盒孵育12 h。余下步骤按照PV-6002试剂盒（购自迈新生物科技有限公司）说明操作，DAB显色，脱水透明，中性树胶封片。
1.5 Realtime RT-PCR
采用Trizol一步法提取软骨细胞总RNA，RNA定量后反转录合成第1链cDNA后，用LINE-GENE 2荧光定量PCR系统（FQD-66A,杭州博日）进行PCR反应，内参基因（GAPDH）与待测基因同批扩增，梯度稀释内参基因法制定相对标准曲线，根据扩增产物的Ct值（扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数）及相对标准曲线求出各种标本所含该基因的模版量，并与其内参量作比，采用溶解曲线法和凝胶电泳法鉴定产物特异性和片段大小。PCR反应体系：总体积50 μl，包括：Realtime PCR MasterMix 25 μl，引物（10 μmol／L）各2 μl，cDNA模版5 μl。PCR反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。引物序列见表1。表1 引物序列（略）
1.6 观察指标
光镜下双盲法按Mankin法评分；番红-固绿染色和MMP-3免疫组化染色切片用HAIAS-1 000系列多功能真彩色病理图像分析系统软件分析，分别于10倍物镜下取软骨表层至钙化层为观察范围，每个标本随机选3个视野测定灰度值并以其平均灰度值均值作为测定结果。Realtime RT-PCR结果采用溶解曲线法和凝胶电泳法鉴定产物特异性和片段大小。
1.7 统计学分析
全部数据以均值±标准差表示，采用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异有显著性。
2 结 果
2.1 细胞形态学观察
Sham组健侧膝关节骨内侧髁关节面平整、光滑，HE染色基质染成粉红色，着色均匀，软骨细胞核呈深蓝色，细胞层次清楚，排列整齐，大小均一。
ACLT组标本可见关节面大部分区域粗糙，可见大量细胞克隆现象及克隆周围大量软骨细胞消失，留下空的软骨囊。有的切片可见明显的丘状隆起的骨赘。
ACLT+CT组术侧部分区域关节面粗糙；基质染色中度不均匀，细胞簇聚多见，有的可见少量软骨细胞坏死区，细胞克隆现象偶见（图1）。Mankin评分结果见表2。表2 Mankin评分结果（略）△ACLT组与Sham组比较，P＜0.05;*ACLT+CT组与ACLT组比较，P＜0.05。
2.2 3组膝关节番红-固绿染色和MMP-3免疫组化染色切片灰度值
番红-固绿染色软骨细胞核染成深蓝色，基质呈红色。空白对照组基质着色均匀，染色深红；ACLT组基质染色重度不均，红染区域很少，大面积绿染，可见细胞克隆和细胞减少；ACLT+CT基质染色轻度不均，红染面积较大，颜色较深（图2）。
MMP-3免疫组化染色关节软骨部分区域的表层胞质和基质染成棕黄色。空白对照组胞质和基质着色区域很少，着色浅；ACLT组胞质和基质着色区域广泛，着色深；ACLT+CT组胞质和基质着色范围较少，着色较浅（图3）。灰度测量结果见表3。表3 番红-固绿和MMP-3免疫组化染色灰度值（略）△ACLT组与Sham组比较，P＜0.05；*ACLT+CT组与ACLT组比较，P＜0.05。
2.3 软骨细胞体外形态及鉴定
软骨细胞刚接种时呈圆形，折光性强。12 h开始贴壁，24 h完成贴壁，贴壁后细胞变暗，形态由圆形向多角形转变。软骨细胞在48 h增殖开始活跃，72 h左右开始对数生长，同时镜下可见刚分裂的圆形折光性极强的细胞，与刚接种时细胞非常相似。培养第8 d，软骨细胞融合约80％，细胞呈结节状聚集生长。传代后，细胞呈分散生长，体积较原代略大，仍以多角形为主（图4）。
取第Ⅱ代软骨细胞行甲苯胺兰染色，基质呈蓝紫色，可确定所培养之细胞为软骨细胞（图5）。
2.4 Realtime RT-PCR结果
3组间检测基因MMP-3，aggrecan的表达水平有差别，具有统计学意义（表4）。扩增产物凝胶电泳显示，产物长度与引物设计的长度一致，所得产物为目的产物（图6）。
图1HE染色结果图2番红-固绿染色结果图3MMP-3免疫组化染色结果图4体外培养软骨细胞形态图5软骨细胞甲苯胺蓝染色（100×）图6扩增产物凝胶电泳结果表4 Realtime RT-PCR结果（略）△ACLT组与Sham组比较，P＜0.05；*ACLT+CT组与ACLT组比较，P＜0.05。
3 讨 论
本实验结果发现Mankin评分结果：ACLT组明显高于Sham组。表明本实验动物模型复制成功。番红-固绿染色和MMP-3免疫组化染色灰度值结果说明在OA的进程中存在基质的降解和MMP-3的高表达。体外实验也显示了OA中软骨细胞MMP-3的表达增高，Aggrecan的分泌减少或降解增加。
ACLT+CT组Mankin评分结果低于ACLT组，表明ACLT+CT组组织学形态优于ACLT组。说明了降钙素对关节软骨的保护作用；番红-固绿和MMP-3免疫组化染色灰度值显示降钙素能降低OA的关节软骨MMP-3的表达，促进基质的分泌或者降解的减少。体外实验中降钙素也下调了OA软骨细胞MMP-3的表达，促进了软骨细胞Aggrecan的分泌或者降解减少。因此作者能够得出结论：以5 IU／（kg·d）给予ACLT新西兰大白兔降钙素6周，能够保护膝关节软骨。而且体内与体外实验的结果一致。
作者以往的研究通过体内实验发现降钙素能够促进软骨细胞分泌GAG和Ⅱ型胶原，或者阻止这2种物质的分解〔2〕。也发现降钙素能够降低软骨组织中MMP-1蛋白和mRNA水平〔3〕。本实验在此基础上，采用体内实验结合体外实验的方法，以MMP-3和软骨基质为对象进行研究，进一步明确降钙素对软骨保护的作用机理。MMP-3也称基质分解素-1，与MMP-1几乎同源。因其自身具有的降解基质的作用和进一步激活其他MMPs家族成员的作用而显得尤其重要〔2〕。本研究在体内实验中采用免疫组化方法，在体外实验中采用Realtime RT-PCR方法发现，ACLT+CT组软骨组织和体外培养的软骨细胞中的MMP-3含量明显低于ACLT组。表明降钙素能够通过降低MMP-3的含量而保护关节软骨。
骨性关节炎的特征表现是关节软骨的进行性退变〔5〕。目前对其主要是针对症状、缓解疼痛和维持关节功能，至今还没有一个被公认的能改变关节炎进程的治疗方法。Ⅱ型胶原和蛋白多糖是关节软骨基质的关键成分，这两种成分占脱水软骨重量的90％〔6〕。MMPs具有降解所有细胞外基质的功能，存在于正常人体，参与伤口愈合、软骨基质的降解及骨吸收并细胞外基质分解的疾病过程，在骨性关节炎软骨退变过程中起着重要作用。由于MMPs对软骨基质的降解，导致软骨的退变、减少、破坏〔7〕。因此治疗骨性关节炎药物的研究很多都着眼于MMPs〔8〕。
降钙素（CT）是一种公认的抗再吸收药物，长期以来一直被用作治疗骨质疏松症〔9〕。Hajjaji等〔10〕采用狗关节炎（ACLT）模型的研究证明了CT能够影响关节损伤的进程。对造模的实验组与非造模的对照组都给与CT，结果显示CT能够减小实验组关节组织损害程度，应用CT后2组的蛋白多糖含量也都增高。本实验也进一步证明了此结果。Sondergaard等〔11〕的研究中CT显示了对OSM,TNF-a诱导的关节软骨的降解有缓解作用，而内在的机理应该是MMPs表达和活性的降低，这与本实验的结果一致。
CT如何对软骨细胞起作用的精确的信号传导途径及软骨细胞本身在增殖分化过程中的信号传导途径在降钙素作用下的变化应是以后研究的重点。
通过本实验可以看出降钙素5 IU／（kg·g)皮下注射能够增加体外培养软骨细胞分泌的Aggrecan的含量以及下调MMP-3的表达；可能通过体内明显减轻兔膝关节软骨基质的降解，减少MMP-3的表达而保护软骨。
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