组织工程化雪旺细胞修复脊髓损伤的研究进展

【关键词】  脊髓损伤

     脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的一直是一个世界性的医学难题，报道脊髓损伤发病率呈逐年上升的趋势。随着对脊髓损伤发病机制的深入研究，已经在细胞分子水平对脊髓损伤后病理生理过程有了全新的认识，并且已经取得了很大的突破。但是神经再生效果不理想，寻找新的修复方法仍然是脊柱外科领域亟待解决的难题。近年来随着基础研究的不断深入，高分子生物材料的出现，利用组织工程修复神经损伤成为可能［1］，为脊髓损伤治疗提供了新的思路。

    1  脊髓损伤治疗现状

    脊髓损伤后经历原发性损伤和继发性损伤的序贯过程，造成不同程度的神经元和胶质细胞的坏死、凋亡，轴突的断裂、脱髓鞘。脊髓的继发性损伤是导致感觉和运动功能丧失的主要原因［2］。SCI后修复面临的主要问题是：(1)脊髓空洞、胶质瘢痕构成阻碍轴突生长的机械屏障［3］；(2)原发和继发的神经元凋亡，使脊髓缺乏自我修复能力；(3)神经营养因子缺乏［4］；(4)损伤局部存在抑制轴突再生的因素如Nogo、髓磷脂相关糖蛋白等［5］。改善脊髓损伤的微环境和细胞移植至脊髓损伤部位是当前研究的热点。针对神经元凋亡，人们进行了大量的研究进行替换或提供新的神经元，从而形成新的神经环路治疗脊髓损伤。尤其是对神经干细胞、胚胎干细胞、脐血干细胞、骨髓基质干细胞等“种子细胞”的研究较多。

    2  组织工程化的雪旺细胞对脊髓的修复作用

    2.1  基本理论和技术

    所谓组织工程化的SCs，是将体外培养的自体或同种异体SCs以及转染有NTF基因的SCs，应用组织工程学原理和技术方法接种或填充到生物组织材料或人工合成材料上，并加入多种神经营养因子作为种子细胞生存的环境，再将其制成有活性的复合性人工神经移植物，通过合适的方法进行动物或临床研究神经损伤修复［6］。这样，一方面依托这些材料的支架作用作为SCs长期存活、生长的基质，另一方面更有效地发挥SCs修复神经损伤、促进轴突再生的作用，从而提供更有利于神经再生的微环境，获得更好的修复效果。

    2.2  种子细胞的选取

    雪旺细胞是周围神经的主要结构和功能细胞，周围神经再生依赖雪旺细胞、基质(膜)及神经生长因子3大主要因素［7］。理想的人工神经是以具有良好生物相容性的可降解高分子聚合物为载体与有活性细胞(雪旺细胞等)结合而成的具有特定三维结构和生物活性的复合体。SCs功能非常活跃［8，9］：(1)可分泌多种神经营养因子，包括神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等［10］；(2)产生促突起生长因子(neurite-promoting factor，NPF)；(3)释放轴突诱导因子。以上物质具有营养和保护受损神经元、促进轴突再生和出芽等作用。其次，雪旺细胞可以作为再生轴突的机械性导管样引导物，支持和引导轴突再生。再次，雪旺细胞可以抑制胶质瘢痕形成，改善损伤脊髓局部微环境。雪旺细胞协助形成神经内膜，清除细胞碎片，促进轴突髓鞘化［11］。因此在周围神经组织工程修复中是理想的种子细胞。

    2.3  生物支架材料的选取

    生物可降解材料支架和整合生长因子是组织工程中的一个重要课题。利用可吸收材料逐步降解的特点，将各种神经生长因子混合到这些材料中可以随之释放，有利于提高神经再生质量，既可诱导雪旺细胞分裂增殖，又可支持和促进神经再生。目前支架材料主要为合成材料或改性天然材料。天然的生物材料比如有壳聚糖、明胶、海藻酸钠等；人工合成的主要为酯的高聚物，比如聚乳酸(polylacticacid，PLA),包括聚L-乳酸(PLLA)，聚D、L-乳酸(PDLLA)等、聚羟基乙酸(polygly-colic acid，PGA)以及二者共聚物(PLGA)等［12,13］。这些材料表面被修饰后，利于细胞黏附和营养因子的聚集。细胞因子根据实验目的选取，如BDNF、NT-3等修饰的细胞移植物可促进损伤的脊髓中感觉轴突的延伸，但会抑制运动轴突的延伸。目前纳米材料的研究也较多，其中磁靶向纳米载体材料是一种广泛应用于癌症治疗及诊断的磁性材料［14］。医用磁靶向载体主要是由铁微粒(或铁氧微粒)和其他活性成分构成的纳米微球，其粒子本身具有生物相容性，并可在体内完全代谢。这些纳米微球具有较强的药物承载能力，在外加磁场的引导下富集到病灶处释药治疗，在病灶部位形成高浓度药物环境，进一步加强了药效。因此利用纳米材料承载神经营养因子和移植细胞做成缓释球或者微粒进入脊髓损伤部位，将是以后的研究方向。

    3  组织工程化雪旺细胞在修复脊髓损伤中的应用进展

    Paino等［15］较早的利用胶原设计出胶原和雪旺氏细胞复合物移植治疗成年大鼠SCI，结果显示：移植物在大鼠体内相容性良好，雪旺氏细胞能够促进轴突长入移植物内并重新形成髓鞘。Christine［16］等也设计出以胶原凝胶为支架复合胚胎脊髓组织移植治疗成年大鼠SCI，术后30 d，在移植区可以观察到胶原支架已完全降解，而胚胎移植物中的神经元、胶质细胞等生长良好。Ramon-Cueto等［17］在研究SCI时切取成年大鼠部分下胸段脊髓，在完全离断的脊髓两断端间置入1根充满雪旺细胞的引导管支架。Woerly等［18］在大鼠胸段构建脊髓横断模型，植入含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽的聚甲基丙烯酰胺(PHPMA)凝胶支架。RGD是整合素即细胞黏附受体的配体，可能是生长发育阶段负责组织构成的分子信号。该研究发现，植入的支架能够促进轴突再生，穿越损伤区域，实验动物有部分运动功能恢复。Novikov等［19］采用雪旺细胞与β-多聚羟丁酸纤维(PHB)支架复合物移植治疗大鼠SCI，结果显示再生的轴突进入并完全通过了移植区。Yoshii等［20］则以胶原丝作为支架植入SCI大鼠，发现损伤区有轴突再生，并沿着胶原丝支架长入远端脊髓内，同时实验动物有明显的运动功能恢复。随着加工制造技术进一步提高，促进轴突再生是目前研究的热点，有学者对其再生的机械性引导物亦作了相关的研究，如用包含SCs的冻干的纤维素细胞填塞多孔支架，通过支架内的细胞转化产生一种分泌型D15A(一种包含BDNF和NT-3 两种功能的神经营养因子)，对这种转基因产物整合，结果显示移植含SCs的支架用于损伤的脊髓中，可产生活化的星形胶质细胞和硫酸软骨素黏多糖，且在支架外表面有髓鞘的轴突形成。Tian等［21］利用层黏蛋白修饰的透明质酸植入脊髓损伤处，经尼氏染色显示有新生的神经元细胞胞体和神经纤维生成，免疫细胞化学法鉴定有胶原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)出现，提示有星形胶质细胞发生。Jain等［22］在原位胶化的琼脂糖材料上，包埋嵌入含有BDNF的缓释微管结构，将其填充入成年鼠脊髓背侧半横切损伤部位，可在宿主脊髓和移植物生物支架分界面处检测到神经微丝蛋白(neurofilament protein，NP）表达阳性的神经元胞体和轴突，及GFAP表达阳性的反应性星形胶质细胞，发现BDNF可诱导神经突长入支架内。国内冯世庆等［23］研究应用壳聚糖-胶原偶联的生物膜为载体，联合移植雪旺细胞(SCs)与神经干细胞(NSCs)在坐骨神经损伤修复过程中所起的作用。NSCs、SCs与壳聚糖-胶原生物膜相容性良好，壳聚糖-胶原生物膜介导的SCs联合NSCs桥接周围神经缺损可使部分神经再生，并且利用神经生物膜联合雪旺细胞修复脊髓取得了很好的效果。而且冯等［24］还利用基因修饰后的SCs联合胚胎脊髓悬液修复脊髓损伤，证实可以促进神经再生。王等［25］雪旺细胞与PLGA体外共同培养后，将其共移植于大鼠横断性脊髓损伤处雪旺细胞与PLGA具有良好的组织相容性，共同移植于损伤脊髓可促进轴突生长及髓鞘再生，但没有与损伤远端联系。这些研究结果显示出组织工程支架应用于SCI修复仍有一段很长的路，但是已经表现出了非常广阔的应用前景。

    随着SCs的提取、纯化、培养扩增技术和转基因技术、自体激活技术的成熟，SCs移植治疗SCI成为最有希望应用于临床的方法之一，但SCI后功能的恢复很大程度上依赖于再生的轴突能否顺利穿过胶质瘢痕交界区域，能否建立有效的突触联接。植入的SCs在局部的迁移距离非常有限，而且其植入损伤脊髓后是否能长时间存活，从而最大限度地保证损伤轴突再髓鞘化和脊髓再生也尚未确定。因此，选择良好的生物支架材料载体引导SCs移植入SCI部位，增加其迁移范围，使再生轴突突破SCI胶质瘢痕界面，是以后的研究方向。

    4  结束语

    脊髓损伤修复是需要多学科参与的工程。组织工程支架材料是脊髓组织工程重要的研究内容。利用新理论、新技术和新材料有效恢复、保持或增强生物体组织功能，修复组织缺损，有着巨大的效益和社会效益。相信组织工程高分子材料联合雪旺细胞移植、并施加电场／磁场刺激修复脊髓损伤可能是未来方向。

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