依那西普对磨屑诱导骨溶解影响的实验研究

                   作者：陈志荣，张亮，吴兴临，陆志东，金群华

【摘要】  ［目的］检测依那西普(Etanercept，Enbrel)对钛颗粒刺激巨噬细胞(macrophages，MΦ)分泌肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素1(interleukin-1,IL-1)、白介素6(interleukin-6,IL-6)的影响，探讨依那西普防治人工关节无菌性松动的可能性。［方法］分离、培养小鼠腹腔巨噬细胞，24 h后分为5组。A组：仅为MΦ；B组：MΦ+钛颗粒；C组：MΦ+钛颗粒+依那西普(10 ng／ml)；D组：MΦ+钛颗粒+依那西普(100 ng／ml);E组：MΦ+钛颗粒+依那西普(1 000 ng／ml)。培养18 h后，用酶联免疫法(ELISA)检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-1、IL-6的含量。［结果］B组TNF-α、IL-1、IL-6含量明显高于A、D、E组(P<0.001)，E组TNF-α、IL-1、IL-6的含量明显低于B组、C组(P<0.00１，E组和D组间无统计学意义(P>0.05)。［结论］钛颗粒可以刺激MΦ分泌大量的TNF-α、IL-1、IL-6，依那西普能够呈剂量依赖型地有效抑制钛颗粒诱导的MΦ分泌TNF-α、IL-1、IL-6，有望成为预防人工关节无菌性松动的药物。

【关键词】  依那西普； 磨屑； 骨溶解

    Abstract：［Objective］To detect the effect of Etanercept on the Ti particles induced TNF-αIL-１ and IL-6 production by macrophage and to evaluate the validity of the etanercept on treatment of aseptic loosening of prosthesis.［Method］Separate and Cultivate mouse peritoneal macrophages were divide into 5 groups after 24 h. Group A was treated with MΦ alone,group B with MΦ+Ti particles,group C with  MΦ+Ti particles + etanercept (10 ng/ml),group D with MΦ Ti particles + etanercept (100 ng/ml) ,group E with MΦ + Ti particles + etanercept (1000 ng/ml). After 18 h,  the production of TNF-α IL-1 and IL-6 in culture supernatants was detected by ELISA.［Result］The levels of TNF-α IL-1 and IL-6 production were much higher in group B than those in group  A, D, E (P<0.001). The levels of　TNF-α IL-1 and IL-6 production were much lower in group E than those in groupB,  C (P<0.001).There were no significant difference in group E, D(P>0.05). ［Conclusion］Is shows the Ti particles could stimulate MΦ to excrete profuse TNF-Α IL-１ and IL-6 production, etanercept can significantly inhibited the production of TNF-α IL-1 and IL-6 secreted by Ti particles induced macrophages in a dose-dependent manner and hope to be a therapeutic candidate for the prevention of aseptic loosening.

    Key words：etanercept;  wear debris;  osteolysis

    缘于假体周围骨溶解的人工关节无菌性松动是内植物失败的常见原因，由于缺乏临床干预去阻止或预防这种并发症，使人工关节的使用受到限制，尤其对于那些需要通过关节置换来改善疼痛和活动的年轻患者。因此迫切需要临床的干预去阻止或预防假体松动。近年依那西普［1］在炎症性骨吸收疾病方面取得了显著的疗效。本文研究依那西普对磨屑诱导骨溶解的影响，为临床防治人工关节无菌性松动提供实验依据。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物

    6～8周的清洁级BALB／C小鼠8～12只，体重18～22 g，雌雄不限(宁夏医学院动物实验中心提供)。

    1.2  主要试剂与药物

    依那西普(Etanercept，Enbrel，Amgen and Wyeth)，钛颗粒(美国ZIM-MER公司提供，微粒直径为3～5 μm)，RPMI 1640细胞培养液(GIBCO)，小牛血清(特级，杭州四季青)，24孔培养板(COSTA)，CO2细胞培养箱(LB-7,东京池本理化株式会社制造)，倒置显微镜及照相系统(Olympus,LX-50)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒(R＆B，最小检测浓度<8 pg／ml)，白介素1(IL-1)ELISA试剂盒(R＆B，最小检测浓度<8 pg／ml)，白介素6(IL-6)ELISA试剂盒(R＆B，最小检测浓度<8 pg／ml)。

    1.3  小鼠腹腔巨噬细胞的分离、培养［2］

    脱颈处死6～8周龄BALB／C小鼠，75％酒精浸泡5 min后，倒立小鼠并腹腔注入无血清RPMI 1640培养液5 ml,仰卧平放并轻揉小鼠腹部2～3 min,静置3～5 min后，无菌条件下打开小鼠腹腔，用注射器抽取腹腔液约4～5 ml。离心洗涤后显微镜下计数，常规10％RPMI 1640培养液(含10％胎牛血清，青霉素100 u／ml,链霉素100 μg／ml)调整细胞至3×106／ml，胎盘蓝排除法检测细胞活力均＞95％。在2块24孔培养板内滴加细胞悬液，每孔1 ml，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，12 h后换液，以去掉未贴壁的细胞，继续培养供实验用。

    1.4  酶联免疫法(ELISA)检测MΦ分泌细胞因子的量

    24 h后将培养细胞分为5组，每组有8个平行孔：A组为单纯细胞组；B组为细胞+1×109／ml钛颗粒组，C组为细胞+1×109／ml钛颗粒+10 ng／ml依那西普；D组为细胞+1×109／ml钛颗粒+100 ng／ml依那西普；E组为细胞+1×109／ml钛颗粒+1000 ng／ml依那西普。将上述细胞置于37℃、5％CO２培养箱中继续培养18 h后取细胞上清液，离心去除钛颗粒，用ELISA法检测TNF-α、IL-1、IL-6的浓度。

    1.5  统计学处理

    研究数据结果以均数±标准差表示(x±s)，采用SPSS 11.5统计学软件包进行单因素方差分析，检验水准为：α=0.05，P<0.05为差异有显著意义。

    2  结  果

    2.1  依那西普对磨屑诱导MΦ分泌TNF-α的影响

    如表1所示B组细胞培养上清液TNF-α浓度明显高于A、C、D、E组(Ρ<0.001)；E组和B、C组有显著性差异(P<0.001)；D组和A、B、C组间有显著性差异(P<0.001)；D组和E组及A组E组间没有统计学意义(P>0.05)。磨屑可以刺激MΦ分泌TNF-α，依那西普能够呈剂量依赖性的显著降低磨屑诱导MΦ分泌TNF-α的量，药物组和磨屑刺激组相比有显著性差异(P<0.001)。表1  ELISA检测依那西普对MΦ分泌TNF-α的影响*为与B组相比P<0.001，  #为与E组相比P<0.001，&为与D组相比P<0.001

    2.2  依那西普对磨屑诱导MΦ分泌IL-6的影响

    如表2所示B组细胞培养上清液IL-6浓度明显高于A、C、D、E组(P<0.001)；E组和A、B、C组有显著性差异(P<0.001)，D组和E组无统计学差异(P>0.05)。磨屑可以刺激MΦ分泌IL-6，依那西普能够呈剂量依赖性的显著降低磨屑诱导MΦ分泌IL-6的量，药物组和磨屑刺激组相比有显著性差异(P<0.001)。表2  ELISA检测依那西普对MΦ分泌IL-6的影响

    2.3  依那西普对磨屑诱导MΦ分泌IL-1的影响

    如表3所示B组细胞培养上清液IL-1浓度明显高于A、B、D、E组（P<0.01);E组和B、C组有显著性差异（P<0.001),D组和E组无统计学差异（P>0.05)。磨屑可以刺激MΦ分泌IL-1，依那西普能够呈剂量依赖性的显著降低磨屑诱导MΦ分泌IL-1的量，药物组和磨屑刺激组相比有显著性差异（P<0.001)。表3  ELISA检测依那西普对MΦ分泌IL-1的影响为与B组相比P<0.01，#为与E组相比P<0.001

    2  讨  论

    假体无菌性松动缘于多方面的因素，包括材料、生物力学和宿主反应。随着材料不断更新和力学设计的更加合理，人们将松动的主要原因聚焦于关节磨屑引起的宿主反应上。目前认为假体周围骨溶解引起人工假体无菌性松动是由于磨损颗粒积聚达到一定浓度后刺激人工假体周围的组织MΦ表达细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子［3］。大量体内和体外实验均表明，TNF-α在磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解中起着关键性的作用［4］。TNF-α在上游调节OC的分化和激活，它既可以通过对成骨细胞(osteoblast,OB)的首效作用调节OC的分化和功能，促进骨吸收，也可以直接诱导OC前体细胞分化成成熟的OC［5］。TNF-α已经被证明在这个进程中居于中枢地位，且已被确认是干预的目标靶向［6］，  因此，抑制TNF-α的释放能大大降低假体的松动率。

    类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是可以产生高水平TNF-α的疾病，且TNF-α在RA关节破坏中发挥着重要的作用。依那西普自1998年引入临床，在RA方面取得了显著的效果，可以明显改善RA的骨质侵蚀［1］。依那西普(etanercept，p75TNF受体：Fc融合蛋白)是一种重组的人可溶性TNF受体蛋白，为二聚体融合蛋白，由人类75kDTNF受体的细胞外配体结合部分与人类IgGFc段连接而成。其作用机制为竞争性地与血TNF-α结合，阻断TNF-α和细胞表面TNF受体结合，降低TNF-α活性，从而在体内对TNF-α介导的炎性反应有抑制作用。TNF-α在假体周围骨吸收和RA的发病中均居于中枢地位，由此作者在体外模拟假体周围骨溶解的生物学过程，研究依那西普能否抑制磨屑诱导的骨溶解。实验证实MΦ吞噬磨屑可以分泌大量的TNF-α、IL-1、IL-6；依那西普可以抑制磨屑活化后的MΦ分泌TNF-α、IL-1、IL-6，且呈剂量依赖型；TNF-a被抑制后IL-1,IL-6的分泌也受到限制，这进一步说明了TNF-α在细胞因子级联反应中居于中枢地位。实验表明依那西普对抑制假体周围骨吸收可能有效。

    作者认为依那西普防治磨屑诱导骨溶解的主要机理是：(1)依那西普作为TNF可溶性受体(sTNF-R)可以和细胞表面的TNF膜受体(mTNF-R)竞争TNF，清除血液中过多的TNF，降低TNF活性。sTNF-R是TNF的天然抑制剂，生理水平的TNF和sTNF-R保持着动态平衡以维持机体内环境的稳定，当TNF浓度高到一定水平后，这种平衡将被打破，TNF和mTNF-R结合产生炎症等生物学反应。依那西普可以补充sTNF-R，使TNF和sTNF-R恢复动态平衡。(2)依那西普通过影响p75mTNF-R的量进而影响核因子-kB(NF-kB)的活化，从而影响OC的生成和活化。sTNF-R来源于mTNF-R，是mTNF-R在蛋白酶作用下其膜外区域脱落形成。依那西普是可溶性p75受体，补充p75sTNF-R可以减少体内p75mTNF-R的分解，增加p75膜受体的量，进而减少了p55膜受体的量，TNF的生物活性主要是通过p55受体传导，故可以调节NF-kB的活化。(3)依那西普不但可以结合TNF-a，也可以结合淋巴毒素，作用更广泛。

    依那西普可以抑制磨屑诱导的MΦ分泌溶骨性细胞因子，有望用于治疗人工关节无菌性松动，作者将进一步研究它在体内抑制骨溶解的情况，为临床治疗提供更充分的依据。

【】
  ［1］ Berthelot JM ，Stephane V，Gregoire C，et al．25 mg etanercept once weekly in rheumatoid arthritis and spondylarthropathy［J］. J Joint Bone Spine，2007，74：144-147．

［2］ 尹美珍，李世普，袁 琳，等.小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定［J］．武汉大学学报(医学版)，2006,27(2)：203-205．

［3］ Haynes DR，Crotti TN， Zreiqat H．Regulation of osteoclast activity in peri-implant tissues［J］．Biomaterials，2004，25(20)：4877-4885．

［4］ 程 涛，戴 闽．人工假体周围骨溶解的基因治疗研究进展［J］．矫形外科杂志，2006，14(9)：699-702.

［5］ Yoshiaki A，Keisuke K，Rei K.Tumor necrosis factor-α induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts［J］. The Journal of Biological Chemistry,2000,275(7)：4858-4864．

［6］ Edward MS，Debbie C，Saara T.Use of volumetric computerized jabbtomography as a primary outcome measure to evaluate drug efficacy in the prevention of peri-prosthetic osteolysis：a l-year clinical pilot of etanercept vs．placebo［J］．Joumal of Orthopaedic Research，2003，21：1049-1055．