格列酮对内皮祖细胞增殖、黏附及迁移能力的影响

【摘要】  目的:观察罗格列酮(rosiglitazone，Ros)对体外培养内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs) 增殖、黏附及迁移能力的影响。方法:以密度梯度离心法获取脐血单个核细胞，培养7 d后收集贴壁细胞并分为正常对照组、单独Ros (1μmol/L、5μmol/L及10μmol/L)组、H2O2（500μmol/L）氧化应激模型组、Ros(1μmol/L、5μmol/L及10μmol/L)和H2O2共同干预组，培养24 h。用流式细胞仪检测细胞表达CD34、CD133、VEGFR-2、VE-Cadherin并用荧光显微镜观察细胞吞噬DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1来鉴定EPCs。分别用CCK-8、普通光学倒置显微镜、改良的Boyden小室检测EPCs的增殖、黏附和迁移能力。结果:与正常对照组相比，单独Ros干预组呈浓度依赖性促进脐血来源的EPCs增殖、黏附及迁移能力（均P<0.05），但是Ros 5μmol/L和10μmol/L组间没有显著差异（P>0.05）；与H2O2氧化应激损伤组相比，Ros能呈浓度依赖性改善H2O2对EPCs增殖、黏附及迁移功能的抑制（均P<0.05），Ros 5μmol/L和10μmol/L干预保护组之间没有显著差异（均P>0.05）。结论:噻唑烷二酮（TZDs）类药物Ros除具有激动PPAR-γ受体降糖作用外，还具有抗氧化应激损伤作用。Ros能促进EPCs功能，改善H2O2致EPCs功能的氧化应激损伤。

【关键词】  罗格列酮 内皮祖细胞 过氧化氢 氧化应激

    Abstract:  Objective: To study the effect of rosiglitazone on the ability of proliferation, conglutination and transfere of endothelial progenitor cell in vitro. Methods: Total mononuclear cells were isolated from the umbilical cord blood with ficoll density gradient centrifugation, after the red

    内皮祖细胞（endothelial progenitor cells， EPCs）被认为是表达CD34/CD133/VEGFR-2的一群细胞，可以分化为内皮细胞，参与成体血管新生，同成熟内皮细胞相比具有迟发性的高增殖性。EPCs具有干/祖细胞增殖分化的特性，大量的动物实验和一些临床研究证明，EPCs是缺血性疾病和修复血管内皮的良好种子细胞，具有巨大的临床应用潜能。越来越多的研究结果揭示，心血管危险因素如高血压、糖尿病、高血脂、年龄、吸烟都会抑制EPCs的功能，促进细胞衰老和凋亡[1，2]，EPCs的数量和功能可作为心血管疾病危险程度新的预测因子。近年来我国的糖尿病发病率明显上升，糖尿病被认为是冠心病的等危症，糖尿病患者10年心脑血管疾病发病率大于20%。噻唑烷二酮(TZDs)Ros是选择性激活过氧化物酶体增殖激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）激活剂,是治疗糖尿病的常用药。最近研究发现，TZDs类药物具有抗炎、抗免疫、保护血管内皮、抗动脉粥样硬化、降血压等胰岛素增敏效果的外作用[3-5]。本实验旨在观察Ros在体外正常培养和H2O2氧化应激损伤模型下对EPCs功能的影响，为明确Ros治疗糖尿病外的血管保护作用提供新的依据。

    1  材料和方法

    1.1  材料  6%羟乙基淀粉（购自Sigma公司），纤维连接蛋白（购自Roche公司），VEGF（购自Peprotech EC公司），PE-CD34（购自Caltag laboratories），FITC-VE-cadherin（购自Bender system公司），PE-VEGF-2及FITC-AC133（购自R＆D System），胎牛血清、M199（购自GIBCO公司），Dil-ac-LDL（购自Molecular probe公司），FITC-UEA-1、rosiglitazone（购自Sigma公司），改良的Boyden小室(江苏海门麒麟医用仪器厂生产)，CCK-8细胞计数试剂盒（购自日本株式会社同仁化学研究所），胃癌细胞株(SGC7901，院上海生科院细胞资源中心提供)。

    1.2  EPCs培养及鉴定

    1.2.1  人脐血培养EPCs：外周血采集于温州医学院第一附属分娩室（已获得知情同意）。[6]，取健康孕妇分娩后脐血50 ml，6%羟乙基淀粉沉淀红细胞，以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，以5×106/cm2接种于包被有纤维连接蛋白的6孔培养板中，每孔加入2 ml包含有20%胎牛血清、VEGF(10 ng/ml)，青霉素(100 IU/ml)及链霉素(100 IU/ml)的M199培养液，置37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。3 d后，洗去未贴壁细胞，添加培养液继续培养，以后每隔3 d换培养液。

    1.2.2  EPCs鉴定：在培养的第7天，细胞以0.25%胰酶消化，制成1×106/ml的单细胞悬液，加入荧光标记的抗CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2及CD133单克隆抗体各10μl(1mg/ml)，流式细胞仪分析内皮祖细胞CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2及CD133的表达情况。根据EPCs具有吞噬DiI-ac-LDL的特性，将DiI-ac-LDL以2.4μg/ml的终浓度加入培养液共孵育3 h，以2%的多聚甲醛固定10 min，再加入3μl FITC-UEA-1(避光操作)，于37 ℃孵育1 h。荧光显微镜下观察。以不加DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1的同批培养细胞为对照。阴性对照采用SGC7901。

    1.3  实验分组  在培养第7天后，以0.25%胰酶将各孔细胞消化下来制成细胞悬液，以等数量细胞接种，随机分为正常对照组、Ros组(浓度分别为1、5、10μmol/L)、H2O2（500μmol/L）氧化应激损伤模型组、Ros+H2O2共同干预组，每组6孔培养24 h后，进行细胞功能检测。

    1.4  CCK-8增殖能力检测  单细胞悬液以1×104/孔的接种密度接种到96孔板，随机分组培养24 h后，更换新鲜培养液，每孔加入10μl CCK-8细胞计数试剂，于37 ℃孵育2.5 h，酶标仪450 nm下读取吸光度OD值。

    1.5  黏附能力检测  单细胞悬液以5×104/孔的接种密度接种到24孔板，随机分组，培养24 h后，各组细胞以0.25%胰酶消化制成细胞悬液，以相同细胞数接种96孔板，置37 ℃培养箱中培养30 min，洗去未贴壁细胞，倒置显微镜下随机选取10个视野(×400)，计数黏附细胞数。       

    1.6  迁移能力检测  单细胞悬液以5×104/孔的接种密度接种到24孔板，随机分组，培养24 h后，各组细胞以0.25%胰酶消化制成细胞悬液，并计数。将培养液100μl加入改良Boyden小室的下室，将2×104/ml EPCs悬浮在150μl培养液，注入上室，培养24 h，刮去滤膜上未移动的细胞，用甲醛固定，苏木素染色，随机选择4个显微镜视野(×200)，计数迁移的细胞。

    1.7  统计学处理方法  用SPSS12.0统计软件进行统计分析，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者采用LSD检验，方差不齐者采用Dunnett's T3检验。

    2  结果

    2.1  EPCs鉴定　培养3 d洗去不贴壁细胞及碎片后，可见典型细胞集落:中间为大量的圆形细胞， 层层叠叠，外周为纺锤形细胞，向外扩散(见图1A)。培养第7天荧光显微镜检显示:细胞吞噬DiI-ac-LDL，显微镜下激发红色荧光(见图1B)，细胞吞噬FITC-UEA-1，显微镜下激发绿色荧光（见图1C），空白对照及阴性对照均无荧光。用流式细胞仪分析表明，表达CD34、CD133、VEGFR-2、VE-Cadherin的细胞分别为(51.21±3.53)%、(19.15±3.45)%、(39.24±3.61)%及(54.28±3.56)%。

    2.2  Ros对EPCs增殖能力的影响  由表1可知，与对照组相比，Ros干预组呈浓度依赖性地促进EPCs的增殖(P<0.05或P<0.01)；与H2O2组相比，Ros加H2O2干预组也呈浓度依赖性地保护EPCs的氧化应激损伤，改善EPCs的增殖能力（P<0.05或P<0.01)。Ros 5μmol/L组、Ros 10μmol/L组和Ros 5μmol/L加H2O2干预组、Ros 10μmol/L加H2O2干预组，两组间差异均无显著性（均P>0.05)。

 

   2.3  Ros对EPCs黏附能力的影响　由表1可知，与对照组相比，(5μmol/L、10μmol/L) Ros组能明显提高EPCs黏附能力(均P<0.01)，1μmol/L Ros干预组无明显差异（P>0.05)；与H2O2组相比，Ros加H2O2干预组也呈浓度依赖性地保护EPCs的氧化应激损伤，改善EPCs的粘附能力（P<0.05或P<0.01)。Ros 5μmol/L组、Ros 10μmol/L组和Ros 5μmol/L加H2O2干预组、Ros 10μmol/L加H2O2干预组，两组间均无显著性差异（均P>0.05)。

    2.4  Ros对EPCs迁移能力的影响  由表1可知，与对照组相比，(5μmol/L、10μmol/L) Ros干预组显著提高EPCs的迁移能力(均P<0.01)，1μmol/L Ros干预组差异无显著性（P>0.05)；与H2O2组相比，(5μmol/L、10μmol/L)Ros加H2O2共同干预组能保护EPCs的氧化应激损伤，改善EPCs迁移能力（P<0.01)。Ros 5μmol/L组、Ros 10μmol/L组和Ros 5μmol/L加H2O2干预组、Ros 10μmol/L加H2O2干预组，两组间差异均无显著性（均P>0.05)。

    3  讨论

    糖尿病患者体内氧化自由基、超氧负离子增多对血管内皮的氧化应激作用超出了生理防御能力，致血管内皮损伤，破坏了血管内膜的完整性从而导致动脉粥样硬化[7]。现在已公认糖尿病与冠心病相关，其可致冠状动脉粥样硬化。内皮祖细胞具有分化为内皮细胞修复损伤血管内皮的潜能，为防治冠脉粥样硬化提供新的思路[8]。有心血管疾病危险因素尤其是合并有糖尿病的冠心病患者体内往往血液高凝，氧化自由基的水平显著升高，循环中EPCs的数量减少及其功能受到抑制。

    PPAR-γ是配体激活的转录因子-核受体家族成员之一，在动脉粥样硬化病变中的内皮细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、平滑肌细胞中均有表达，对动脉粥样硬化的发生、、转归发挥着重要的调控作用。研究发现，TZDs除胰岛素增敏降糖作用外还有抗炎、抗免疫、抗动脉粥样硬化、降血压等血管保护作用。无论在对糖尿病患者还是对非糖尿病患者的研究中均发现，TZDs类药物能起到血管保护作用。但其具体机制不是很明确[9，10]，EPCs可能在其中发挥重要作用。Wang等[3]研究发现，Ros能促进骨髓来源的血管前体细胞（APC）向内皮系转化，增加球囊损伤血管内膜的内皮覆盖率，抑制平滑肌细胞增殖，这一作用可能与APC的eNOs活性有关。但是Gensch C等[11]研究发现，TZDs类药物吡格列酮促进大鼠皮下聚乙烯抑制物上血管新生，减少内皮祖细胞的凋亡，改善内皮祖细胞功能，可能是通过PI3K/Akt而不是eNOs途径起作用。Onuta G等[4]研究发现Ros能显著抑制小鼠颈动脉移植后细胞免疫、炎症反应，抑制中膜、内膜平滑肌增生，减小动脉粥样硬化斑块形成。

    Dernbach等[11]研究发现与脐静脉内皮细胞相比，EPCs具有较低的活性氧水平；H2O2（500μmol）或LY-83583(10μmol)干预培养18 h，EPCs较脐静脉内皮细胞胞内的活性氧水平低、凋亡细胞少，其认为与EPCs胞内高表达过氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶有关。由于EPCs自身具有很强的抗氧化、低活性氧的特点，本实验采用过氧化氢500μmol/L作用24 h，制造细胞的氧化损伤模型[12，13]。本实验证实Ros在正常培养条件下促进EPCs增殖、黏附、迁移能力；在H2O2氧化应激损伤培养条件下Ros能保护H2O2致氧化应激损伤对EPCs的功能抑制，改善增殖、黏附、迁移能力。因此Ros在糖尿病的同时可以起到与糖代谢无关如抗氧化应激损伤、抑制炎症反应、保护循环中的EPCs作用，而发挥修复损伤内皮的血管保护作用。其保护EPCs可能是通过活化PPAR-γ再通过PI3K/Akt和eNOs途径起作用，具体机制待进一步实验明确。

【】
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