黄素对慢性应激大鼠肾上腺、血清ACTH和免疫功能的影响

【摘要】  目的:探讨姜黄素对慢性不可预知应激模型大鼠的肾上腺结构、血清促肾上腺皮质激素（ACTH）浓度和免疫功能的影响及其意义。方法:采用多种不可预知的刺激方式交替、持续应激20 d建立大鼠慢性应激模型。随机分为正常对照组、应激模型组、姜黄素组（2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg）、丙咪嗪组（10 mg/kg），每组6只。采用HE染色技术，观察应激大鼠肾上腺结构的改变及姜黄素的作用。通过测定应激大鼠外周血中白细胞（WBC）数量和血清中ACTH和白细胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）含量的改变，观察姜黄素的作用。结果:慢性应激大鼠与正常对照组比较肾上腺皮质增厚，髓质萎缩，外周血白细胞数量明显减少（包括淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞百分比下降），血清中ACTH和IL-1β含量明显增加。姜黄素组大鼠肾上腺结构变化不明显，外周血WBC数量不同程度增加，血清中ACTH 和IL-1β含量降低。结论:姜黄素可能通过调节下丘脑-垂体-肾上腺轴以及免疫系统功能，在慢性应激大鼠模型中显示出抗抑郁活性。

【关键词】  姜黄素 应激 抗抑郁 肾上腺 白细胞计数 ACTH IL-1β

    Abstract:  Objective: To observe the effects of curcumin on the structure of adrenal gland, the level of serum ACTH and immune function in chronically stressed rats. Methods: Male rats were subjected to a variety of unpredictable stressors for 20 days. They were randomly divided into control group, stress group, curcumin group (2.5 mg/kg，5 mg/kg，10 mg/kg) and imipramine group (10 mg/kg). And then regular method was used to prepare pathologic section of adrenal gland, and blood cells analytic system was used to detect white blood cell (WBC) count (including relative WBC percentages) in peripheral blood. The serum level of ACTH and IL-1β were also detected using the enzyme linked immunosorbent assay. Results: Chronic stress resulted in diffuse hyperplasia of the adrenal cortex and atrophy of the adrenal medulla in rats, and the serum level of ACTH was increased, which suggested that stress-adaption failure of the adrenal gland occurred, while adrenal gland of the rats pretreated with curcumin （10mg/kg） prior to each stressor for 21 days did not result in any pathologic changes and the level of ACTH decreased. Moreover, chronic stress also significantly reduced the WBC count and relative WBC percentages in the peripheral blood, including the percentage of lymphocytes, monocytes, neutrophils, however, curcumin reversed these changes and raised WBC count, along with relative WBC percentages significantly. Meanwhile, the serum level of IL-1βwas increased in chronically stressed animals, and curcumin also declined the level of this stress hormone. Conclusion: These results suggest that curcumin exerts antidepressant effects against chronic stress, and the mechanism may be mediated by regulating the function of the hypothalamo-pituitary-adrenal (HPA) axis and the immune system.

    Key words:  curcumin; stress; antidepressant; adrenal gland; WBC count; ACTH; IL-1β

    “解郁丸”是一种传统复方中药,常用来与抑郁和焦虑相关的精神疾病,姜黄是其中的主要成分之一。姜黄素(curcumin)是姜黄的主要活性成分,具有抗氧化、清除自由基、调节免疫、保护神经系统等作用[1]。前期研究发现，姜黄素在小鼠悬尾等行为绝望模型、大鼠强迫游泳以及嗅球切除抑郁模型中显示出明显的抗抑郁活性[2，3]。不可预知的慢性应激模型模拟抑郁症的环境诱因，模型动物的行为改变与内源性抑郁症症状相似，是具有较高价值的抑郁模型。因此，本研究采用综合性的刺激方式交替进行，建立大鼠慢性应激模型，通过测定大鼠肾上腺结构的改变，血清ACTH含量、外周血白细胞计数和细胞因子水平的变化，从神经内分泌-免疫角度来解释姜黄素抗抑郁的可能作用机制。

    1  材料和方法

    1.1  药品、试剂与仪器  姜黄素（含量≥95%），丙咪嗪购自美国Sigma公司，姜黄素用花生油溶解，丙咪嗪用双蒸水溶解。ACTH测定试剂盒，北京尚柏生物工程公司提供；IL-1β试剂盒购自美国RB试剂公司。

    精密天平（FA-1004），上海精科天平厂生产；全自动酶标仪（550型），BIO-RAD生产；TGL-16GA冷冻离心机，上海安亭仪器厂生产；普通光学显微镜（IM），Olympus公司生产；LEICA冰冻切片机(型号CMl850-1-1，德国)。

    1.2  实验动物及模型建立  雄性SD大鼠，180～200 g，购自北京大学医学部实验动物中心，动物合格证号：SYXK（京）2002-0002。饲养条件：6只/笼，室温(25±1)℃，湿度(50±10)%，光照，自由摄食饮水。所有动物于饲养环境中适应3～5 d后开始实验，实验前禁食12～16 h，食水自由。随机分为正常对照组、应激模型组、姜黄素组（2.5、5、10 mg/kg）、丙咪嗪组（10 mg/kg）。在预实验中，花生油和双蒸水用作对照，两种溶液对大鼠行为学结果的影响没有明显差异。因此，正式实验选择花生油作为对照组。

    按[4]制作大鼠模型。每日测定体重，于每天试验前60 min 按体重给予不同剂量的姜黄素（2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg，i.g.）、花生油，或每天试验前30 min按体重给予丙咪嗪（10 mg/kg，i.p.）。第21天断头杀鼠。

    1.3  检测指标  大鼠处死后摘取肾上腺放入10%福尔马林固定，经脱水、透明、包埋后切片，HE染色镜检、照相。取全血5～10 ml，室温放置20 min后离心：1000 r/min，10 min，分离血清，-20 ℃冻存备用。用ELISA方法测定大鼠血清中ACTH和IL-1β的含量，严格按照试剂盒使用说明操作。另取全血20μl，在F-800血细胞计数仪上进行WBC计数，并取血做光镜涂片，在显微镜下进行WBC分类计数，各类WBC所占百分比。

    1.4  统计学处理方法  采用单因素方差分析，组间差异采用Dunnett's检验。

    2.1  姜黄素对应激大鼠肾上腺厚度以及肾上腺病理改变的影响  正常大鼠肾上腺病理切片显示结构清晰，由外向内分为肾上腺皮质和髓质部分，其中皮质又分为球状带、束状带和网状带；慢性应激大鼠肾上腺皮质肥厚，髓质萎缩，结构层次模糊；给予姜黄素和丙咪嗪后应激大鼠肾上腺结构清晰，层次分明。同时，如表1所示，与正常大鼠相比，应激大鼠肾上腺皮质厚度明显增加（P<0.01），而给药组大鼠的肾上腺皮质厚度较应激组均有减少（P<0.01）。

    2.2  姜黄素对应激大鼠WBC计数的影响  表2显示，慢性应激大鼠与正常组比较，血清WBC总数以及淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞计数都显著下降，姜黄素和丙咪嗪可以不同程度地逆转上述变化，且差异有显著性（P<0.05或P<0.01）。

    2.3  姜黄素对应激大鼠血清ACTH和IL-1β含量的影响  如表3所示，应激对照组大鼠血清ACTH和IL-1β含量明显高于正常组大鼠，姜黄素5和10 mg/kg组以及丙咪嗪10 mg/kg组对慢性应激所致ACTH和IL-1β含量的上升具有一定的抑制作用，与应激对照组相比差异有显著性（P<0.01）。

    3  讨论

    抑郁症的病理机制非常复杂。应激是机体对各种应激原所表现出来的非特异性反应状态，包括精神、神经、内分泌和免疫等方面的反应，下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）是应激反应的中枢。当机体长期处于应激状态，HPA轴功能持续亢进，交感神经兴奋，分泌促肾上腺皮质激素释放激素（CRH），促使ACTH的产生，作用于肾上腺皮质，使之分泌大量的糖皮质激素，而HPA轴持续亢进，将严重影响人体的身心健康，使机体出现抑郁症状[5]。本实验中大鼠经20 d慢性综合性应激后，肾上腺皮质出现增生、肥厚以及髓质出现萎缩，说明慢性应激对HPA轴活性的影响，而给予姜黄素（10 mg/kg，i.g.）和经典三环类抗抑郁药丙咪嗪（10 mg/kg，i.p.）后应激大鼠肾上腺皮质肥厚、髓质萎缩、结构层次模糊等有明显改善。大量研究表明，抑郁症患者血清肾上腺皮质激素水平升高，而经抗抑郁药后随着抑郁症状的缓解皮质激素含量也下降[6]。实验中，模型组大鼠血清中ACTH含量较正常组明显升高（P<0.01），而给予姜黄素（5 mg/kg、10 mg/kg，i.g.）和丙咪嗪（10 mg/kg，i.p.）后，ACTH含量下降（P<0.01），与上述研究结果一致，提示姜黄素可能通过影响ACTH的水平，发挥拮抗慢性应激的作用。

    抑郁症的“巨噬细胞假说”认为，体内细胞因子的大量分泌可导致严重的抑郁症[7]。而内分泌系统和免疫系统之间的作用途径是双向的，神经或淋巴细胞衍生的细胞因子以相互反馈机制调节HPA轴以及靶器官。本实验显示，慢性应激大鼠血中白细胞总数和淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞计数都明显降低，进一步验证了抑郁大鼠的免疫功能低下。另外，抑郁症动物模型大鼠血清中IL-1β水平明显升高（P<0.01），姜黄素（5 mg/kg、10 mg/kg，i.g.）和丙咪嗪（10 mg/kg，i.p.）治疗后，血WBC数量逆转，而且血清中IL-1β水平下降（P<0.01），对应激大鼠免疫功能低下有改善作用，说明姜黄素有可能通过调节免疫功能从而减轻抑郁症状。

    姜黄素在慢性应激大鼠模型中显示出抗抑郁活性，这一作用可能与HPA轴功能的改变以及免疫功能的变化有关。但姜黄素抗抑郁作用的确切机制还有待进一步研究。

【】

[1] Miquel J, Bernd A, Sempere JM, et al. The curcuma antioxidants: pharmacological effects and prospects for future clinical use[J].Arch Gerontol Geriatr, 2002, 34 (1) : 37-46.

[2] Xu Y, Ku BS, Yao HY, et al. The effects of curcumin on depres-sive-like behaviors in mice[J].Eur J Pharmacol, 2005, 518 (1) : 40-46.

[3] Xu Y, Ku BS, Yao HY, et al. Antidepressant effects of curcumin in the forced swim test and olfactory bulbectomy models of depression in rats[J].Pharmacol Biochem Behav, 2005, 82 (1) :200-206.

[4] Molina VA, Volosin M, Cancela L, et al. Effect of chronic variable stress onmonoamine receptors: influence of imi- pramine administration[J]. Pharmacol Biochem Behav, 1990, 35(2): 335-340.

[5] Holsboer F. Stress, hypercortisolism and corticosteroid re- ceptors in depression:implications for therapy[J]. J Affect Disord, 2001,62(1-2): 77-91.

[6] Magarinos AM, McEwen BS, Flugge G, et al. Chronic psycho- social stress causes apical dendritic atrophy of hippocampal CA3 pyramidal neurons in subordinate tree shrews[J]. J Neurosci, 1996; 16(10): 3534-3540.

[7] Connor TJ, Leonard BE. Depression, stress and immunologi-cal activation: the role of cytokines in depressive disorders [J]. Life Sci, 1998; 62(7): 583-606.