内皮抑素基因对鼠移植性肝癌抑制作用的实验性研究
作者：王建立 李朝阳 孙学英 藏运金 沈中阳
【摘要】 目的：探讨血管内皮抑素endostatin对体内人肝癌细胞在体内的影响。方法：将以pcDNA3.1为载体的鼠源性 endostatin基因转染人肝癌细胞SMMC7721建立的裸鼠的肝癌模型。应用免疫组化和Western blot检测endostatin的转染和表达。用免疫组化计数肿瘤血管密度（MVD）和血管内皮生长因子（VEGF）的阳性率。同时观察转基因肿瘤的生长情况。结果：可见endostatin在肝癌细胞的稳定表达和分泌，其MVD显著低于对照组（P<0.05）,VEGF同对照组比较差异亦有显著性（P <0.05）。 结论：endostatin基因对人肝癌细胞SMMC7721在裸鼠体内的生长有显著的抑制作用，endostatin能减慢肿瘤生长速度，但不能完全消除肿瘤。
【关键词】 基因，endostatin 肝癌 体内转染
Study on endostatin inhibitation of the growth of transplanted hepatic cancer in nude mice
【ABSTRACT】 Objective: To explore the effect of endostatin on the growth of human liver carcinoma in vivo. Methods: Mice endostatin gene was transferred into SMMC 7721 cancer established in nude mice. Immunohistochemistry and Western blot analysis were applied to examine the transfection and expression. The microvessel desity (MVD), the positive rate of vascular endothelial growth factor (VEGF) were studied using immunohistochemical methods. The growth of the cancer of the endostatin-transfected were observed. Results: Immunohistochemistry and Western blot proved endostatin expression and secretion from endostatin-transfected SMMC7721 cells, compared with negative control group, MVD and VEGF were lower (P<0.05). Conclusions: Endostatin mediated by pcDNA3.1 might inhibit the growth of human hepatic cancer SMMC7721 in vivo.
【KEY WORDS】 Gene,endostatin ·Hepatic cancer·In vivo
传统的肿瘤手段主要针对增殖异常的肿瘤细胞，但不可避免的杀伤正常体细胞。20世纪70年代，美国学者Folkman提出了肿瘤生长依赖于血管的观点［1］，目前已证明肿瘤的生长及转移必须有新生血管的形成来维持。近年来，在肿瘤领域研究中已确立了肿瘤血管生成在肿瘤中的重要地位和肿瘤的抗血管生成疗法（antiangiogeni cancer therapy）的意义。本实验采用人肝癌细胞MMC7721建立裸鼠肝癌的皮下转移瘤模型，研究血管内皮抑素（endostatin）对肝癌生长的抑制作用，并探讨其对肝癌细胞凋亡的影响。
1 材料和方法
１．１ 材料 4～5周龄裸小鼠（购自院上海实验动物中心），雌雄各半，在特异性无致病原菌条件下（specific pathogen free condition，SPE）饲养。人原发性肝癌细胞系SMMC7721购于中国科学院上海细胞生物学研究所。用含有10%小牛血清的RPMI 1640（购于GIBCO公司）在37℃、5%CO2条件下培养。pcDNA3.1，endostatin /pcDNA3.1由孙学英博士惠赠。限制性内切酶BamHⅠ，HindⅢ购自生物工程（大连）有限公司。质粒DNA小量纯化试剂盒（MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 2.0，50次量），购自生物工程（大连）有限公司。其他试剂包括：endostatin的抗体(Calbiochem-Novabiochem, La Jolla，CA)、兔多克隆VEGF抗体（Lab Vision Corporation, CA, USA）、抗CD31抗体（Pharmingen，CA，USA）和二抗（VECTASTAIN UniversaL Quick Kit，Vector Laboratories，Burlingame, CA，USA）。
1.2 方法
1.2.1 细胞传代培养及分组 用RPMI 1640细胞培养液，25 cm2/50 ml细胞培养瓶传代培养3～4代后，再用75 cm2/200 ml细胞培养瓶扩传培养，待细胞生长至对数生长期，用0.25%胰蛋白酶消化，用PBS制成细胞悬液，调整细胞密度至3×107 ml-1，用于建立动物模型。荷瘤裸鼠随机分为2组，分别为pcDNA3.1组（对照组）和endostatin/pcDNA3.1组（治疗组），每组12只。其中6只观察生长曲线，另6只切取肿瘤标本供实验室检查用。
1.2.2 转染裸鼠 制备DH5α感受态大肠埃希菌:重组质粒（即携带目的基因的质粒，含青霉素抗性遗传标志）转化感受态的DH5α大肠埃希菌。碱裂解法制备少量质粒DNA、酶切、电泳并测序，证实含目的基因。碱裂解法制备大量质粒DNA：5%葡萄糖、0.01%TritonX-100将质粒稀释成1 mg/ml，然后与脂质体按1：3体积比混合，转染裸鼠。
1.2.3 检测指标和检测方法
（1）观察endostatin对肿瘤的抑制作用。转染基因后，每天观察肿瘤生长状态，第0、 3、 6、 9、 12和 15天测量肿瘤长短径， 以观测目的基因对肿瘤的抑制作用。
（2）免疫组织化学检测。基因转染肿瘤2 d后杀死小鼠制作切片（10 μm），用兔多克隆抗鼠endostatin抗体，VEGF抗体孵育过夜，二抗孵育30 min，苏木精染色。随机选择10个视野endostatin阳性细胞数及平均阳性细胞数。平均阳性细胞数=（阳性细胞数×100）/细胞总数。
（3）Western blot 分析。肿瘤组织在4 ℃下搅碎，溶解在蛋白溶解液中。4 ℃下10000 r/min离心10 min去除组织碎片。将蛋白重新溶解在10%聚丙烯酰胺SDS胶中，电泳将蛋白转移到硝化纤维素C膜上，用5%的小牛血清将膜封闭，然后用一抗和二抗孵育，X光下显色。Scion Image软件分析结果。
（4）计算微血管密度(MVD)［2，3］。转染质粒4 d后制作10 μm肿瘤切片，用CD31抗体做免疫染色。随机选择5个视野在40倍显微镜下记数染色血管数，计算3个染色数最高的视野，用同心圆法计算MVD［4，5］。每组至少观测5～6个肿瘤切片。
（5）观察肿瘤细胞凋亡 用-70℃冷冻的肿瘤制作6 μm肿瘤切片。用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡。在荧光显微镜下，随机选择10个视野计算总的凋亡细胞数和凋亡指数（AI）。AI= （凋亡细胞数 ×100）/细胞总数。
2 结果
2.1 肿瘤生长曲线 注射空载体pcDNA3.1，肿瘤生长迅速，在第12天肿瘤生长至1 cm；注射endostatin在1周内较对照组生长缓慢（P<0.05），但1周后肿瘤生长较快，与对照组比较差异不明显（图1）。肿瘤体积=π/6×(长径×短径2)，π值取3.14。
2.2 免疫组化和Western blot结果 检测肿瘤转染endostatin后其蛋白和血管内皮生长因子(VEGF)的表达，发现肿瘤转染endostatin后其蛋白表达较对照组明显增多，并且VEGF表达减少，与对照组比较有明显的统计学意义（P<0.05）。见图2。
2.3 肿瘤MVD 肿瘤转染endostatin能够明显抑制肿瘤血管生成，其诱导肿瘤血管密度的减少具有统计学意义（P<0.05）。 而肿瘤中任何一点至最近的血管的中位数距离明显延长(P<0.05)。而此变化与VEGF表达的下调有直接的联系（图3）。
2.4 细胞凋亡结果 注射空载体的肿瘤组织中仅有少量细胞凋亡，但在转染endostatin的肿瘤组织中凋亡细胞成倍增加，其差异有显著性（P＜0.01），AI和注射pcDNA3.1有明显差异（图4）。另外观察到，除因endostatin基因转染可以阻断肿瘤生长所必需的VEGF外，还降低了抗凋亡因子Bcl-2的表达。
3 讨论
endostatin是1997年美国哈佛大学医学院的O’reilly从小鼠血管内皮细胞的培养上清液中提取的一种新的强效血管生成抑制因子。endostatin 是Ⅹ、Ⅷ型胶原的C端，相对分子质量2.0×104 ，是第2个被发现的肿瘤源性的血管生成抑制因子，是高活性的内皮细胞特异抑制剂，能引起内皮细胞的凋亡，显著降低Bcl-2和Bcl-XL抗凋亡蛋白，对转移性肿瘤和原发性肿瘤均有明显的抑制作用。有报道endostatin能减少胃癌血管生成，增加胃癌细胞凋亡，从而抑制肿瘤的生长［６］。由于其作用对象是血管内皮细胞，基因组遗传相对稳定，肿瘤很难产生耐药。因此endostatin成为近年来国内外研究热点之一。
但endostatin重组蛋白的制备较困难，半衰期短，患者需要长期持续用药，且血液中不能维持高水平稳定的有效浓度，一旦停药，肿瘤生长可能反弹,影响其疗效。应用目前的基因工程技术，很难制备具有较高活性的蛋白质。而基因将外源性基因导入宿主细胞，使自主细胞源源不断地产生外源性抗癌蛋白质，获得比重组蛋白更好的疗效［７］。本实验应用对人体毒副作用小的pcDNA3为载体，将目的基因endostatin转染到肝癌细胞MMC-7721，经免疫组化及Western blot证实，转染endostatin的人肝癌细胞能稳定表达和分泌endostatin，抑制肿瘤血管生成；由于肿瘤细胞缺氧和营养供给减少导致肿瘤细胞凋亡，达到抑制肿瘤生长的目的。同时发现，endostatin并未完全抑制肿瘤生长，此结果可能与endostatin分泌表达较低有关系，另一方面可能是肿瘤的血管生成是一个多环节多因素的复杂过程。故认为如果能采用更高效表达的载体系统及多环节多基因的联合治疗，则有可能进一步提高endostatin的抗肿瘤效果。
【】
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