结肠癌根治术后腹腔热化疗对T淋巴细胞亚群及细胞因子的影响
作者：胡敏超 方万强 余健雄 吴瑞景 付春利
【摘要】 目的：探讨腹腔热化学对机体细胞免疫水平的影响。方法：将135例结肠癌根治性切除术后分为A,B两组治疗。A组65例，采用卡铂、5?Fu以及丝裂霉素分次溶入加热至45～50℃的生理盐水中腹腔注射；B组65例将上述化疗药物溶入常温生理盐水中腹腔注射，C组62例为健康正常对照组且未行腹腔灌注化疗。分别观察3组病例外周血T淋巴细胞亚群和细胞因子（IL?4与IFN?γ）的变化。结果：A组热化疗后15 d时，CD4+水平较术后第7天明显增加(t=2.32，P≤0.05)，CD8+水平明显低于B组同期水平(t=3.00，P≤0.05)，IL?4水平较术后第7天明显下降(t=2.65，P≤0.05)，而IFN?r水平明显增加（t=2.70，P≤0.05）。CD4＋百分比与IFN?r水平正相关，CD8＋百分比与IL?4水平正相关。结论：结肠癌根治性切除术后热化疗，在杀灭肿瘤细胞的同时，可诱导机体产生抗肿瘤的细胞免疫应答。
【关键词】 结肠肿瘤 热疗；化学治疗；细胞免疫
Abstract Objective: To investigate the effect of intraperitoneal thermochemotherapy on T?lymphocyte subsets and cytokine after radical resection of colon cancer. Methods: A total of 135 cases of colon cancer were divided into group A and B. Group A(65 cases) were treated with carboplatin, 5?Fu and mitomycin which were dissolved respectively with 45℃?50℃ normal saline and injected into abdomen cavity after radical resection, and Group B were treated with above mentioned drugs which were soluted with normal saline of normal temperature and injected into the abdominal cavity after radical resection. And there were 62 cases of healthy individuals as control (group C). The level of T?lymphocyte subsets and cytokine were explored in these groups. Results: In group A at 15 day after thermochemotherapy, the level of CD4+ T?lymphocyte subsets increased significantly(t=2.32,P≤0.05), CD4+ T?lymphocyte subsets decreased significantly (t=3.00,P≤0.05), the level of IL?4 decreased(t=2.65,P≤0.05) but IFN?r increased significantly(t=2.70, P≤0.05). The percentage of CD4+T ?lymphocyte subsets was positively coherent with the level of IFN?r, and so was the percentage of CD8+T ?lymphocyte subsets with the level of IL?4. Conclusion: Intraperitoneal thermochemotherapy after radical resection of colon cancer can not only eradicate disseminated tumor cells in abdomen but also induce tumor?specific cellular immunity.
Key words Colon neoplasm； Thermotherapy； Chemotherapy； Cellular immunity
结肠癌浸润浆膜层后往往发生肉眼或镜下的腹膜播散种植，而结肠癌的门静脉转移甚至可发生Dukes A期，结肠癌腹膜播散种植和肝转移是术后复发和转移的重要原因，即使采用D4廓清手术都不能清除潜在的癌细胞腹膜和门静脉播散[1～5]。恶性肿瘤对高温的耐受性差，热疗可促使肿瘤细胞坏死、促使肿瘤细胞相关抗原的暴露以及提升肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，这是腹腔热化疗的理论依据之一[6, 7]。近年来许多研究证明，腹腔热灌注化疗能明显减少结肠癌腹腔内种植和肝转移[8, 9]，但是腹腔热化疗对机体免疫功能的影响国内外报道较少，我院2001～2006年共对65例结肠癌根治性切除术后行热化疗，观察热化疗对机体细胞免疫水平的影响，现报告如下。
1 临床资料
1.1 一般资料：本组135例，男86例，女49例，年龄21～82岁，平均（51.2±7.3）岁,中位年龄52.0岁。133例为单发癌灶，2例为2个癌灶（乙状结肠和升结肠以及结肠脾曲和横结肠）。单发瘤灶部位：乙状结肠癌34例，升结肠癌26例，结肠脾曲癌12例，横结肠癌22例，结肠肝曲6例，降结肠癌11例，盲肠癌22例。Dukes分期：A期6例，B期53例，C期72例，D期4例。病理类型：管状腺癌21例，乳头状腺癌37例，黏液腺癌32例，印戒细胞癌24例，未分化癌15例，鳞癌4例，腺棘皮癌2例。本组病例术前均作结肠镜检查，镜下活检病理提示为结肠癌。
1.2 分组：本组135例采用双盲随机抽信封的方法分为两组。热化疗组（A组）65例。常规化疗组（B组）70例。两组在性别、年龄组成、肿瘤分期以及病理类型各方面无统计学差异，资料具有可比性。另取良性结直肠疾病（结肠良性息肉、重度痔以及结肠冗长综合征等）而住院的62例患者作为正常对照组（C组），入院前3月内以及住院期间，无放疗化疗过程，无严重感染过程。
1.3 治疗方法
A组患者于根治术后1周应用中心静脉穿刺设备经麦氏点处腹壁将导管置入腹腔，穿刺成功后滴注500 mL生理盐水2 h无特殊不适后，将化疗药物溶入生理盐水500 mL中，加热至45～50℃，直接进行腹腔热灌注，1次/d×5 d为1个疗程。第1天灌注卡铂（200 mg/m2），第2天灌注5?Fu（400 mg/m2），第3天灌注丝裂霉素(MMC，5 mg/m2），第4天灌注5?Fu 1（400 mg/m2），第5天灌注MMC(5 mg/m2）[8,10]。B组患者于根治术后1周将化疗药物溶入生理盐水500 mL中，腹腔穿刺以及化疗药物的方案同A组。C组根据原发疾病进行相应的专科治疗。
1.4 监测方法
FITC和PE标记的鼠抗人CD4+和CD8+单克隆抗体购自EB公司，采用流式细胞仪监测患者外周血T淋巴细胞亚群的变化，IL?4和IFN?γ的酶联免疫吸附（ELISA)，检测试剂盒购自EB公司，监测患者治疗前后血清细胞因子水平的变化。
A组和B组于手术后第7天、化疗完成后第7天和第15天后空腹抽血，C组患者于入院后第1天空腹抽血，标本留取方法同A组和B组。
无菌取空腹静脉血5 mL，肝素抗凝处理，1000 r/min离心5 min，取下层细胞团，细胞团内培养液少于25 μl，送流式细胞学检查T淋巴细胞亚群。步骤：加入FITC和PE标记的CD4+、CD8+表面分子的单克隆抗体15 μl，混合均匀，4℃下避光反应30 min。PBS洗涤2次后，弃上清，加入1 mL的1%甲醛，固定30 min。加样枪将荧光标记抗体结合的细胞加入Beckman?Coulter流式细胞仪的检测孔内，检测淋巴细胞CD4+和CD8+表面分子的表达以了解外周血内T淋巴细胞亚群的变化情况［11］。数据以表达率的95%可信区间作为衡量表达情况的标准。
其余上清再次4000 r/min离心5min，吸取上清，-20℃冻存，标本满24个时ELISA方法监测IL?4和IFN?γ。步骤：用俘获抗体包被96孔板，4℃孵化过夜。吸干孔内液体，每孔加300 μL洗涤液，共洗涤3次。每孔加200 μL的Assay Diluent封闭，室温下孵化1 h。吸干封闭液后洗涤板孔。除空白孔外，分别将不同浓度（2倍连续稀释）标准品、待测血清加入相应的反应孔中（100 μL/孔），每个标本设3个复孔。用封板胶纸封住反应孔，置37℃孵箱孵育2 h。重复吸干、洗涤板孔5次。除空白孔外，每孔加入抗体工作液100 μL，用封板胶纸封住反应孔，置室温孵育1 h。重复吸干、洗涤板孔5次。除空白孔外，每孔加入酶结合物工作液100 μL，用封板胶纸封住反应孔，置室温下孵箱孵育30 min。重复吸干、洗涤板孔7次。每孔加底物溶液100 μL，室温下孵箱孵育15 min。每孔加终止液50 μL。反应完毕后，即刻在酶标仪上读取样本孔及标准品孔的OD450nm值和OD570nm值，以二者差值和对应的细胞因子浓度的常用对数值，分别作纵、横坐标，绘制标准曲线，从标准曲线求出样本的细胞因子浓度[12]。
1.5 统计学处理：3组患者的计量资料的描述采用均数±标准差（±s），采用单因素方差分析进行统计学比较，组间均数比较应用独立t检验进行比较，非正态分布计数资料组间比较用Mann?Whitney U检验，淋巴细胞亚群和细胞因子之间的关系采用Spearman相关分析，α设定为0.05。所有数据均在机SPSS13.0统计软件上进行运算。
2 结 果
2.1 T淋巴细胞亚群变化：见表1。
经单因素方差分析，3组患者的CD4＋以及CD8＋变化存在统计学差异经独立样本的t检验，A组和B组术后第7天以及化疗后第7天的CD4＋低于C组（t=1.86，P<0.05；t=2.02，P<0.05）；而A组和B组之间于术后第7天以及化疗后第7天无明显差别（t=1.50，P＞0.05；t=1.42，P＞0.05），和B组化疗后15 d相比较，A组热化疗后15 d的CD4+明显增加(t=2.60，P<0.05)；经配对t检验，A组热化疗后15 d的CD4+水平较术后第7天以及化疗后第7天明显增加(t=2.32，P<0.05)。
经配对t检验，A组患者热化疗后15天的CD8+水平较术后第7天以及化疗后第7天明显下降（t=2.46，P<0.05；t=1.99，P<0.05；）；B组患者化疗后15 d的CD8+水平较术后第7天以及化疗后第7天有所增加，但未达到统计学差异（t=1.12，P＞0.05；t=1.33，P＞0.05），经独立样本的t检验，A组患者化疗后15 d的CD8+水平和C组无明显差别（t=1.28，P＞0.05），B组患者化疗后15 d的CD8+水平明显高于A组同期水平(t=3.00，P<0.05)。。表1 3组患者淋巴细胞亚群变化
2.3 外周血IL?4和IFN?r水平变化：见表2。
经单因素方差分析，3组患者外周血IL?4和IFN?r水平变化存在统计学差异（t=2.29，P<0.05）。
经独立样本的t检验，A组和B组术后第7天以及化疗后第7天的IL?4均高于C组（t=1.75，P<0.05；t=2.30，P<0.05），而A组和B组之间于术后第7天以及化疗后第7天无明显差别（t=1.22，P＞0.05；t=1.40，P＞0.05），和B组化疗后15 d相比较，A组热化疗后15 d的IL?4明显下降(t=2.26，P<0.05)；经配对t检验，A组热化疗后15 d的IL?4水平较术后第7天以及化疗后第7天明显下降(t=2.65，P<0.05)。
经配对t检验，A组患者热化疗后15 d的IFN?r水平较术后第7天以及化疗后第7天明显增加（t=2.70，P<0.05；t=2.82，P<0.05），B组患者常规化疗后15 d以及化疗后第7天的IFN?r水平较术后第7天明显下降（t=2.22，P<0.05；t=2.19，P<0.05；）；经独立样本的t检验，A组患者热化疗后15 d的IFN?r水平和C组无明显差别（t=1.22，P＞0.05），A组患者热化疗后15 d的IFN?r水平明显高于B组同期水平(t=2.05，P<0.05)。表2 3组患者的外周血IL?4和IFN?r水平变化
2.4 等级相关分析：见表3。
3组患者的外周血CD4＋百分比与IFN?r的水平呈正相关关系， CD8＋百分比与IL?4的水平呈正相关关系。表3 IFN?r与CD4+以及IL?4与CD8+百分比的相关分析
3 讨 论
消化道恶性肿瘤患者致死的主要原因是局部复发、腹腔内种植和肝脏转移，腹腔内注射化疗药物能增加局部药物浓度，对恶性肿瘤腹膜转移患者，腹腔化疗可直接作用肿瘤病灶，因而比静脉化疗更有价值；此外，腹腔给药时，药物可由腹膜吸收进入门静脉系统，起到预防和杀灭结肠转移癌细胞的作用［3, 8, 9］。
尽管腹腔化疗具有一定的优越性，但是单纯化疗并不能彻底杀灭肿瘤细胞，大多存在一定程度的肿瘤细胞残留，而且化疗进一步破坏机体的免疫功能，在这两个主要因素下，复发不可避免［2］。采取合适的辅助手段，增强化疗效果，提高机体的免疫状态，有可能降低或杜绝复发的机会。
近年来的研究表明，一定时间的高温(42～50℃)处理能促使肿瘤细胞暴露肿瘤相关抗原，肿瘤的免疫原性增强，诱导机体的抗肿瘤的细胞免疫应答，这是热疗能增强抗肿瘤免疫效应主要机制［6, 7］。但是，临床上不能采取过高的温度，以避免对机体造成损害，报道，43℃维持5 min下能使25%的肿瘤细胞坏死，另有报道50℃维持5 min可使100%肿瘤细胞发生渐进性坏死，说明机体能耐受适宜的热疗温度且杀伤肿瘤细胞［13］。
T淋巴细胞是机体抗肿瘤细胞免疫系统中最重要的效应细胞，CD3+、CD4+细胞的数量一定程度反映机体免疫水平。手术和常规化疗均不能纠正恶性肿瘤患者的免疫水平低下的状态，甚至加剧患者的免疫抑制状态，这也是临床上常规后复发的原因之一［14］。我们的观察发现，热化疗15 d后，患者的CD4+的T细胞亚群百分比明显增加，基本达到了非肿瘤患者的免疫水平，这说明，患者的细胞免疫水平改善，在一定程度上逆转了患者免疫水平低下的状态。
细胞因子在抗肿瘤细胞免疫过程中作用是不可缺的，不同细胞因子的此消彼长往往意味着机体免疫状态变化，IFN?γ可以增强杀伤细胞的免疫活性，具有高效的免疫上调作用；而IL?4对杀伤细胞的活化有负调节作用［8, 14, 19］。我们运用ELISA检测方法，定量监测了外周血中IFN?γ和IL?4的水平，观察发现：热化疗后外周血中IFN?γ水平增加，而IL?4水平下降，这意味着机体免疫水平上调，一定程度上消除了免疫抑制或免疫耐受状态。
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