纯二氧化碳气体对卵巢癌细胞生长及运动能力的影响
【关键词】 二氧化碳；肿瘤细胞；细胞培养；细胞生长；细胞运动
Effect of carbon dioxide on growth and movement of human ovarian carcinoma cell in vitro
【Abstract】 Ｏbjective:To observe the effects of carbon dioxide on growth and movement of human ovarian cancer cells in vitro Such study will provide a primary evidence for the safety of CO2 pneumoperitoneum laparoscopy surgery in malignanciesMethods:Immortalized ovarian epithelial carcinoma cell (SKOV3 cell line) cultures were exposed to carbon dioxideCell growth was determined by spectrophotometric assay(MTT)Cell movement was determined with the use of WoundassayThe results were compared with control cells by paired test and liner regressions analysis.Results：The levels of MTT of carcinoma cells that were exposed to carbon dioxide had increased after 4 days in cultureThe increased cell growth had a linear relationship to the length of carbon dioxide exposure.The doubling time of carcinoma cells exposed to carbon dioxide was shorter than that in control cells.The number of migrating cells (SKOV3)into the wound surface were no significant difference to be found among four groups (P>005)Conclusions：Carbon dioxide exposure increases the growth of human ovarian carcinoma cells in vitroThere is no effect on movement of SKOV3 cell after exposed to carbon dioxide
【Key words】 Carbon dioxide;Ovarian cancer cell;Cell cultures;Cell growth;Cell movement
近10余年来，腹腔镜手术以其创伤小、痛苦少、恢复快等优点深受患者欢迎，国内外已广泛应用腹腔镜处理妇科良性疾病。随着腹腔镜技术和设备的不断，其适应证逐渐拓宽至恶性肿瘤领域，但腹腔镜肿瘤外科手术引起的切口种植率要高于开腹手术［１］,致使腹腔镜手术在恶性肿瘤领域的应用存在争议，其焦点在于腹腔镜手术中所使用的人工气腹介质CO2是否促进腹腔恶性肿瘤细胞的生长。CO2气体作为人工气腹介质可以被腹膜迅速吸收、不助燃、安全而在临床上得到广泛应用。本实验旨在研究模拟CO2气腹条件下，对体外培养的卵巢癌细胞SKOV3生长增殖及运动能力是否有影响。
１ 资料与方法
１１ 临床资料 选取人卵巢癌细胞SKOV3(山东大学齐鲁肿瘤中心馈赠)，体外培养于RPMI1640完全培养液(含体积分数为10%小牛血清、10万U/L青霉素及10万U/L链霉素)中。传2～3代后，制成细胞悬液，以台盼蓝染色后在荧光显微镜下计数，活细胞比例>95%，调整浓度为1×105/ml的细胞悬液。
１2 方法 将细胞悬液分别注入A、B、C、D 4个96孔细胞培养板中，每孔接种细胞数1×104，每板共接种42孔。D板为对照组，放入CO2培养箱(内含5%CO2，95%的空气，37℃)中培养。将A、B、C板分别放入无菌密闭塑料袋内，用CO2自动气腹机充入100%CO2气体，充气压力为10mm Hg，于细胞培养箱中维持模拟气腹状态，A板持续时间为60min，B板为120min，C板为180min。充气结束后，将A、B、C板由密闭塑料袋中取出，脱离纯CO2环境，放入CO2培养箱中继续培养。于CO2处理后24、48、72、96h，分别进行四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应［2］，用分光光度计在波长492nm处测定OD值。并采用细胞计数绘制各组细胞生长曲线，细胞倍增时间，同时检测各培养液的PH值。
划痕法细胞运动性测定：采用改良的Birth等［3］创建的划痕法（Woundassay）检测细胞随机运动能力。取24孔培养板，先将纤维粘连蛋白（FN）用灭菌PBS缓冲液稀释成浓度10mg/ml，每孔加300μl，室温放置1h后用PBS缓冲液清洗2次。于暴露纯CO2后24h，各组取10孔制备细胞悬液，按1×105/孔接种于24孔培养板，每种细胞重复3个孔，于37℃ 5%CO2培养箱常规培养至细胞融合度达60%～80%时，用细胞刮刀在孔内侧单层细胞表面划出一条宽度为4mm的横行无细胞刮除带，用PBS缓冲液漂洗2次，以去除划下的细胞，加入新鲜培养液继续培养，每3h于倒置相差显微镜下利用方格测微尺测定细胞向空白区的位移情况。为避免细胞倍增对实验的影响，试验在18h后终止，计数迁移到单位长度划痕区的细胞数。于暴露纯CO2后72、96h重复上述步骤。
１3 统计学分析 采用方差分析q检验。
2 结果
21 CO2处理后各时间MTT值见表1 暴露纯CO2不同时间后24、48、72h各组间MTT值无显著性差异，96h后A、B、C 3组MTT值较D（对照）组明显增高，差异有显著性（P<005），并且与暴露于纯CO2的时间呈正相关。
表１ CO２处理后各时ＭＴＴ值（略）
*P<005 vs.A、B、D组
22 各组细胞倍增时间见表2 暴露于纯CO2环境不同时间后，肿瘤细胞的倍增时间均小于对照组,并且随暴露时间的延长，倍增时间逐渐缩短。经统计学处理A、B、D组间无显著性差异（P>005）。C、D间及A、C间有显著性差异（P<005）。
23 各组培养液pH值见表3 暴露于纯CO2环境后,各组细胞培养液pH值明显低于对照组（P<005），脱离纯CO2环境后，各组细胞培养液的pH值逐渐升高，但仍低于对照组。
表2 各组细胞倍增时间（略）
表3 暴露于CO2后不同时间相各组细胞培养液PH值（略）
24 各组细胞的随意运动能力变化 细胞的随意运动能力通过迁移到单位长度划痕区内的细胞数表示,各组差异无显著性，结果见表4。
表4 各组不同时间迁移到单位长度划痕区的细胞数（略）
3 讨论
本实验在离体条件下，研究纯CO2气体环境对肿瘤细胞生长及随意运动能力的影响。肿瘤细胞暴露于纯CO2环境后，MTT比色值在72h内与对照组无显著性差异，第96小时后，MTT比色值明显高于对照组。MTT比色值的升高，反映细胞代谢加强，细胞增殖。根据MTT值描绘各组肿瘤细胞的生长曲线与细胞计数方法得出的生长曲线有很好的相关性（呈平行关系）。该实验结果显示肿瘤细胞暴露于纯CO2环境一定时间后，可促进肿瘤细胞增殖，并且这种促细胞增殖的作用与暴露时间成正比。但产生此种现象的机理尚不清楚，肿瘤细胞生存环境的改变可能是影响肿瘤细胞增殖的原因。本实验发现在暴露纯CO2环境后2min内，各组细胞培养液由粉红色变为黄色，脱离纯CO2环境时各组培养液的pH值均低于对照组。由此结果可推出，纯CO2环境造成一过性的酸性环境，在酸性环境中，细胞有能力将有氧代谢转化为无氧代谢，肿瘤细胞中与有丝分裂相关的酶类可能被激活［4］，从而促进肿瘤细胞生长。纯CO2环境不仅造成一过性的酸性环境，而且会造成严重的缺氧环境。报道［5］，肿瘤细胞在缺氧培养一定时间后BCL2、PCNA及VEGF蛋白表达均升高，反应缺氧环境能促进肿瘤细胞的抗凋亡作用，肿瘤细胞增殖活性加强。然而，亦有相反结果的研究报道，蒋宇林等［6，7］研究认为体外模拟的CO2环境对卵巢癌细胞的生长有抑制作用。Schmidt等［8］研究结果显示，暴露于纯CO2环境2h后，肿瘤细胞的生长速度较对照组明显减慢。关于CO2环境对肿瘤细胞生长的作用，仍需进一步研究。
肿瘤的侵袭和转移性与肿瘤细胞的运动能力密切相关，许多实验均证明高侵袭、高转移的肿瘤细胞往往具有较强的运动能力。本实验利用划痕法检测肿瘤细胞在基质FN上的移位运动能力，结果显示肿瘤细胞暴露于纯CO2环境一定时间后与对照组相比，肿瘤细胞的运动能力无明显变化。该实验结果说明纯CO2环境对肿瘤细胞的随意运动能力无影响。
本实验结果证实纯CO2环境可促进体外培养的肿瘤细胞生长，但对肿瘤细胞的运动能力无影响。在体外试验中，肿瘤细胞所处的环境与体内气腹条件下的环境尚存在差异，因此，体外试验结果并不能完全说明腹腔镜手术环境下CO2气腹对肿瘤生长的影响作用，需要进一步设计与临床手术过程相似的体内动物实验研究。
文献：
［1］ Hirabayashi Y,Yamaguchi K,Shiraishi N,et alDevelopment of portsite metastasis after pneumoperitoneum［Ｊ］Surg Endosc,2002，16:864-869
［2］ 薛庆善，主编.体外培养的原理与技术［Ｍ］.北京:出版社,2001:343
［3］ Birch M,Mitchell S,Hart IR,et alIsolation and characterization of human melanoma cell variants expressing high and low levels of CD44［Ｊ］Cancer Res,1991,51:6660-6665
［4］ Jacobi CA,Sabat R,Bohm B,et alPneumoperitoneum with carbon dioxide stimulates growth of malignant colonic cells［Ｊ］Surgery,1997,121:72-76
［5］ 祝亚平,丰有吉,李惠敏，等.卵巢癌细胞株SKOV3ipl对缺氧的适应及其与VEGF、BCL2蛋白表达的关系［Ｊ］.癌症杂志,2003，13(3):207-209
［6］ 蒋宇林，郎景和，冷金花，等.体外模拟的二氧化碳气腹环境对卵巢癌细胞增殖的影响［Ｊ］.妇产科进展，2004，13(2)：92-95
［7］ 蒋宇林，郎景和，冷金花，等.体外模拟的二氧化碳气腹环境对卵巢癌细胞凋亡的影响［Ｊ］.中华妇产科杂志，2004，39(9)：634-635
［8］ Schmidt AI,Reismann M,Kubler JF,et alExposure to carbon dioxide and helium reduces in vitro poliferation of pediatric tumor cells［Ｊ］Pediatr Surg Int,2006，22:72-77
