结直肠肿瘤中DNA甲基化研究进展
【摘要】 DNA甲基化异常参与了结直肠肿瘤的发生、及转移，对其研究有助于进一步认识结直肠肿瘤的发病机制，提出新的防治措施。
【关键词】 结直肠肿瘤 表观遗传学 DNA甲基化
结直肠肿瘤是一种常见病，随着生活水平的提高其发病率逐年上升，以往对于遗传学在其发病中的作用有着广泛的研究。近来由于表观遗传学研究的发展，对于结直肠肿瘤的发病机制有了许多新的认识，特别是DNA甲基化异常的作用被广泛研究。本文就此做一简要综述如下。
1 DNA甲基化
DNA甲基化，即是由DNA甲基转移酶(DNMT)催化，将甲基转移到胞嘧啶5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的过程，它是脊椎动物DNA唯一的共价修饰方式，是一种表观遗传学（epigenetic）现象。表观遗传学主要研究的就是包括DNA甲基化在内的，非DNA序列变化引起的，在细胞分裂中可遗传的基因修饰作用，其他还包括组蛋白修饰、染色质重塑等。DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸，在某些区域CpG二核苷酸序列重复出现，G+C 含量大于50％，其长度大于200个碱基，这些区域被称为CpG岛，大约50％ 的人类基因中含有CpG岛，通常CpG岛位于这些基因上游调控区的启动子中，正常情况下，这些启动子区的CpG岛大都处于非甲基化状态。DNA甲基化在维持染色体结构、X染色体失活、基因印记和肿瘤的发生中起着重要的作用。
DNA甲基转移酶(DNMT)在DNA初始甲基化及甲基化的维持中发挥着重要作用。目前研究认为，DNMT家族至少包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a和DNMT3b 4个成员，DNMT1起着维持甲基化的作用。DNMT2因缺乏DNMT1和DNMT3的N-端调节区，故认为DNMT2不具备催化CpG位点甲基化的作用，目前功能还不清楚。DNMT3亚家族包括DNMT3a和DNMT3b两个成员，主要是参与从头甲基化，即在没有甲基化的DNA双链上进行甲基化［1］。DNMT不同成员在细胞中各自发挥作用，但并不是孤立的，它们需要与许多活性蛋白结合才具有功能，共同参与对DNA甲基化的调节［2］。
2 DNA甲基化与肿瘤
正常组织中异常甲基化的发生频率很低，但在人类肿瘤中却发现了许多肿瘤相关基因的启动子区CpG岛发生了异常甲基化。这些基因包括抑癌基因（p16、p15、p14、p73、APC）、DNA修复基因(hMLH1、GSTP1、MGMT)、细胞黏附相关基因（CDH1，CDH13）、凋亡控制相关基因（DAPK）及解毒控制基因（GSTP1）等［3］，它们在肿瘤的发生、发展和转移中发挥作用。所以目前认为DNA甲基化的异常参与了肿瘤的发生机制，并且是肿瘤发生的早期事件之一。
目前基础研究表明DNA甲基化异常在肿瘤发生、发展中的作用主要包括：（1）DNA甲基化异常促使C～T突变发生，研究表明DNA甲基化使胞嘧啶转变成5 mC，而5 mC的突变率比其他碱基(包括没有甲基化的胞嘧啶)突变率高。同时DNA甲基转移酶(DNMT)在催化突变反应方面有重要作用，参与导致C-U-T的转换，包括p53在内的许多肿瘤抑制基因的5 mC在恶性肿瘤中都是突变的热点，DNA甲基化异常在这些突变中发挥一定的作用［4］。（2）DNA甲基化异常影响基因的表达。肿瘤组织中基因组甲基化状态不同于正常组织，表现为整个基因组的低甲基化与部分区域特别是基因启动子区CpG岛的高甲基化共存，这种甲基化状态与许多肿瘤相关基因的异常表达有关。肿瘤中基因组甲基化程度普遍降低，其中许多特异癌基因也出现低甲基化，同时伴随它们的表达有不同程度的增加，有报道认为在细胞群体中，DNA低甲基化可能是导致肿瘤形成的原始细胞克隆增殖的关键因素之一［5］。但低甲基化与基因表达的关系还有待进一步研究阐明。肿瘤细胞中许多抑癌基因的启动子区CpG岛发生高甲基化目前被广泛研究，这种甲基化异常与该基因的转录抑制相关，并能通过有丝分裂稳定的遗传。所以认为，启动子区CpG岛的异常高甲基化是抑癌基因失活的一种机制。如研究发现在结直肠癌细胞株中，一个p16等位基因发生突变而未甲基化，另一个未突变但高度甲基化，最终该基因发生转录抑制［6］。此外越来越多的基因被报道在肿瘤中因高甲基化而导致转录抑制，这些基因涉及细胞周期调控、生长和分化(ER基因)、血管生成(THBS1基因)、粘连和转移(TIMP3基因)、DNA修复(MGMT基因)等多方面，表明高甲基化在肿瘤形成中发挥着作用。（3）DNA甲基化异常可以导致基因组的不稳定。肿瘤中整个基因组普遍存在低甲基化，主要发生在DNA重复序列中，如微卫星DNA、长散布元件(LINES)、Alu顺序等，这种广泛的低甲基化会造成基因组不稳定。Wong等对36例肝细胞癌的1号染色体的微卫星序列Sat2进行研究，发现69％肝细胞癌的Sat2 DNA发生低甲基化，且Sat2 DNA的低甲基化与染色体1q12断裂、不正常的1q形成显著相关［7］。可见正常的甲基化位点出现去甲基化时，可发生基因组的不稳定，进而促进肿瘤进程。
3 结直肠肿瘤中DNA甲基化
3.1 结直肠肿瘤中基因的甲基化异常 结直肠肿瘤中基因的甲基化异常随着表观遗传学的发展，较早被认识，特别是在结直肠癌腺瘤—癌序列发展中相关的基因，其甲基化状态的改变，已被广泛研究。如APC、P53、MMR等基因，大量研究发现［8～11］它们在结直肠癌中除有突变外，同时都存在启动子区CpG岛的高甲基化，这可能与这些基因的失活沉寂有关。如Hawkinsetal等［12］检测发现，在存在微卫星不稳定（MSI）的散发性结直肠癌中，hMLH1突变的发生率低于10％，但该基因启动子区域的甲基化发生率大于90％，在hMLH1启动子区域出现的频繁的甲基化，可能是导致微卫星不稳定（MSI）发生的hMLH1基因失表达的原因。此外在结直肠癌中也发现一些抑癌基因，如p14ARF，p15INK4b，p16INK4a，p21WAF1，p73，WT1等较正常组织中存在不同程度的高甲基化［13～16］，但这些基因发生高甲基化与其表达之间的关系及在结直肠癌发病中的作用还未完全阐明，还有待进一步研究。其他如人类钙黏附蛋白E编码基因(E-cadherin)［17］、TPEF基因［18］、TIMP3基因［19］等在结直肠癌中都有高甲基化发现，它们可能与肿瘤的血管生成，粘连转移相关。近来发现与结直肠癌发生没有明显相关的基因，如MYOD1基因［16］，及在正常结肠上皮细胞中非甲基化也不表达的基因，vimentin基因［20］，在结直肠癌细胞中也存在甲基化水平的改变。由此可以发现结直肠癌中甲基化异常改变要比我们预想的复杂的多，并不仅仅表现为抑癌基因启动子区的高甲基化，对于非肿瘤相关基因的甲基化异常及整个基因组普遍存在的低甲基化，其机制和作用还未被揭开，所以有必要对整个结直肠癌细胞基因组甲基化谱进行分析。Jordi等［21］利用AIMS(甲基化间区位点扩增技术)对结直肠癌基因组的初步研究发现，结直肠癌基因组表现为明显的去甲基化状态，特殊基因启动子的高甲基化与基因组整体高甲基化程度相关，提示甲基化作用对整个基因组是平均的，同时对11例结直肠癌伴有腺瘤的患者检测分析发现，结直肠癌细胞高甲基化程度高于腺瘤，去甲基化水平两者相当，提示去甲基化是肿瘤的早期改变，甲基化程度随病变的进展逐步累积，其他也对利用甲基化谱进行结直肠癌分型及甲基化与预后的相关性进行了初步分析，但仍缺乏足够证据和理论依据，进一步研究仍在进行中。
3.2 CpG岛甲基化表型(CIMP) Toyota等［22］研究大量结直肠癌后，将甲基化分为两类，A型年龄相关甲基化（age-related methylation）和C型肿瘤相关甲基化（cancer-related methylation）。年龄相关甲基化是随着年龄增长逐步出现的某些基因发生甲基化，这类甲基化最初在研究结直肠癌与甲基化的关系时发现，因为结直肠癌中的某些甲基化在正常结直肠黏膜中也存在，并且甲基化的程度随着年龄增加而升高，有研究认为这类甲基化可能与散发性结直肠癌的形成有关［23］，年龄相关甲基化的基因很多，它们参与调节细胞的生长和分化，如ER基因、IGF2基因等。肿瘤相关甲基化（cancer-related methylation）起初被认为只出现在肿瘤组织中，正常组织中不存在，许多抑癌基因的甲基化属于此类，如INK4a，P14/ARF，hMLH1等，对于许多这类基因同时的甲基化被称为具有CpG岛甲基化表型(CpG Island Methylation Phenotype，CIMP) ［22］。CIMP可能通过对细胞周期、血管生成和凋亡相关基因的影响，参与肿瘤的发生和发展。目前研究发现CIMP表型可能与近端肿瘤、老年、女性，BRAF和KRAS的高突变率，p53的低突变率及肿瘤分化差等相关［24］，同时研究也发现绝大多数的具有微卫星不稳定的散发性结直肠癌具备CIMP表型 ［25，26］，故有学者提出按是否存在MSI划分具备CIMP表型的结直肠癌，分为CIMP1-MSI(+)和CIMP2-MSI(-)。但Samowitz等［27］的大样本研究发现，MSI(+)的CIMP结肠癌与MSI(-)的CIMP结肠癌都表现为易发生于近端结肠，高龄患者的临床特点，并且都易存在BRAF V600E突变，不过MSI(+)的CIMP结肠癌比MSI(-)的CIMP结肠癌更易发生于近端，更易发生BRAF突变（64.1％与17.6％），同时也更多的为TP53野生型及分化差，由此支持CIMP表型与结肠癌的临床病理特点相关联，是否具有MSI主要影响这种临床病理表型的表现程度。对于产生CIMP表型的原因目前还不清楚，可能与遗传或环境因素有关。
3.3 CpG岛甲基化参与的结直肠癌发病机制 结直肠癌的发病以往被认为是多基因突变累积的结果，近来随着表观遗传学特别是其中甲基化研究的发展，对结直肠癌发病机制提出了新的探讨。目前认为遗传学改变和表观遗传学的改变都参与了结直肠癌的发生发展过程，年龄相关甲基化（age-related methylation）随着年龄的增长在正常细胞中逐步累积，其中一些涉及细胞生长、分化调控的基因发生甲基化使细胞处于高增殖状态（hyper-proliferative status），在此基础上一些关键基因（gatekeeper）发生突变失活（如APC、b-catenin等）造成癌前病变，在癌前病变向恶性肿瘤转变的过程中及恶性肿瘤局部进展和远处转移的过程中，肿瘤相关基因甲基化参与其中，对于多个抑癌基因同时发生的启动子甲基化即具有了CpG岛甲基化表型(CIMP)。但目前对于甲基化异常发生的原因以及肿瘤中普遍存在的基因组低甲基化如何参与肿瘤的发生机制还不清楚，仍然需要进一步研究。
4 DNA甲基化在结直肠癌诊断和中的应用
DNA甲基化作为一种表观遗传学现象，在结直肠癌组织中普遍存在，同时相比于基因突变的检测，利用甲基化特异性PCR(MSP)或定量甲基化特异性PCR(quantitative MSP)［28］，DNA甲基化的检测更方便灵敏。不仅肿瘤组织标本，只要含有肿瘤细胞DNA的生物样本(血浆，粪便等)都可以用来检测DNA的甲基化，所以DNA甲基化的检测有应用于结直肠癌诊断筛查的潜力，特别是粪便DNA甲基化异常的检测，作为一种无创的检测方法目前被广泛研究。甲基化检测的关键是寻找某些特定基因的甲基化，用来作为结直肠肿瘤筛查的标志物。Muller 等学者利用检测粪便样本中SFRP2基因的甲基化情况，来检查结直肠肿瘤，发现与对照组相比敏感性90％，特异性77％，希望通过与其他标志物的组合进一步提高敏感性和特异性［29］。也有研究报道采用改良的粪便DNA提取和保存技术，检测粪便提取DNA中Vimentin基因甲基化情况，发现用它检测结直肠肿瘤的敏感性为72.5％，特异性为86.9％，而假阳性的发生与高龄有关［30］。DNA的甲基化不仅仅存在于结直肠肿瘤组织中，正常肠黏膜上皮组织中同样存在着甲基化改变，这种DNA甲基化程度的差异可能作为肿瘤患病风险的指标。Cui等［31］研究发现影响IGF2基因的遗传印迹消失，在结直肠癌患者正常黏膜中的发现率为30％，但在健康人群中只有10％，由此预测通过进一步研究遗传印迹消失是很有价值的结直肠癌患病风险标志。此外，不少研究将DNA的甲基化异常与结直肠肿瘤的进展程度、预后、对放化疗的反应等临床表现相联系。有报道认为甲基化所引起的基因失表达是产生肿瘤化疗耐药性的重要原因，通过试验可以证明利用去甲基化药物恢复基因的表达（主要是错配修复基因hMLH1），可以恢复肿瘤对化疗药的敏感性［32］。 甲基化不同于基因突变，不涉及基因结构的改变，作为DNA的一种修饰作用，甲基化是可逆的，通过作用于这种可逆的过程，逆转甲基化改变，可以为结直肠肿瘤的治疗开辟一条新路。Laird 等［33］的试验发现，利用基因杂合性改变和药物的作用，降低DNA甲基转移酶(DNMT)的活性，降低DNA的甲基化，可以明显减少试验组小鼠肠道腺瘤的数目，从而抑制肠道肿瘤的形成。目前使用最多的抗甲基化药物是DNA甲基转移酶1（DNMT1）抑制剂5-aza-dC，以及它的改进型zebularine，对于它们的用法及剂量有广泛研究，取得不少进展，其中在血液肿瘤治疗方面取得明显临床效果［34］，但对于实体肿瘤的治疗作用仍需进一步的临床验证。由于很多DNA甲基化异常发生于肿瘤形成的早期，该类药物能否用于肿瘤预防值得关注。但是目前该类药物缺乏基因特异性，有发生潜在风险可能，如何使该类药物具有基因特异性仍需进一步研究。
5 结语
对于结直肠癌中DNA甲基化异常的研究，是对结直肠癌发病分子机制的重要补充，为全面了解结直肠癌的发病机制提供了可能。DNA甲基化在结直肠癌诊断和治疗方面的应用，为结直肠癌的诊断和治疗开辟了新路，将对结直肠癌的现有诊疗产生重大影响。
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