新型血管生成抑制融合基因ENDO-VGEI151对胃癌抑制作用的比较评价

　【摘要】  目的  比较内皮细胞抑制素－血管内皮细胞生长抑制因子151（ENDO-VGEI151）融合基因与ENDO和VGEI151单基因及联合基因对胃癌的抑制作用，评价融合基因的治疗价值。方法  建立荷胃癌裸鼠模型，48只荷瘤裸鼠随机分成6组：PBS组、Ad LacZ组、Ad ENDO-VGEI151组、Ad ENDO组、Ad VGEI151组及Ad ENDO＋Ad VGEI151联合组，每组8只。接种后第5天起在瘤体内和瘤周注射滴度为2×109pfu/ml的相应重组腺病毒500μl，联合基因组用250μl Ad ENDO+250μl Ad VGEI151，隔日1次，共10次。末次注射24h后处死动物，测量种植瘤体积和瘤重、抑瘤率、肿瘤微血管密度（MVD）、肿瘤细胞凋亡指数（AI）、血管内皮细胞生长因子（VEGF165）表达指数；流式细胞仪（FCM）和电镜观察检测癌细胞凋亡情况。结果  融合基因组、ENDO组、VGEI151组和联合基因组种植瘤体积分别为（391.67±146.43）mm3、（1568.48±198.23）mm3、（1832.85±178.82）mm3、（822.86±163.41）mm3；抑瘤率为88.11%、52.39%、44.37%、75.02%；MVD分别为（11.50±3.42）、（35.18±4.15）、（34.37±2.72）、（21.49±2.74）；AI分别为（61.39±6.36）%、（35.84±6.52）%、（39.69±5.24）%、（45.50±7.64）%；VEGF165表达指数为（31.58±4.06）%、（58.74±7.64）%、（53.25±4.42）%、（43.15±4.57）%；FCM分析凋亡细胞比例分别为（16.04±4.07）%、（3.15±1.17）%、（2.83±0.86）%、（7.15±2.15）%。融合基因与两单基因或联合基因组相比，组间抑瘤率、MVD，AI及VEGF165表达差异均有显著性（P＜0.01）。结论  融和基因ENDO-VGEI151通过抑制血管内皮细胞增殖，下调癌细胞表达VEGF165，协同抑制肿瘤内新生血管形成，诱导癌细胞凋亡，其疗效明显优于单基因和联合基因治疗，值得深入研究。

　　【关键词】  胃癌；基因治疗；血管内皮细胞生长抑制因子151

　　Comparative evaluation of inhibitory effects of endostatin-vascular endothelial growth inhibitor151 chimeric gene therapy on gastric carcinoma

　　【Abstract】  Objective  To compare the inhibitory effects of endostatin-vascular endothelial growth inhibitor151 (ENDO-VGEI151) chimeric gene on gastric carcinoma with endostatin or VGEI151 gene alone and combination of the endostatin and VGEI151.Methods  The recombinant adenovirus containing ENDO-VGEI151 chimeric gene, ENDO gene and VGEI151 gene was constructed.48 nude mice were randomly divided into 6 groups which were subjected to the injection of PBS,Ad LacZ,Ad ENDO-VGEI151,Ad ENDO,Ad VGEI151 and Ad ENDO+Ad VGEI151 respectively.The injection was administered 10 times at an interval of 1 day.Twenty-five days after implantation, tumor size and weight,inhibition rate,intratumoral microvessel density(MVD),apoptotic index（AI）,and VEGF165 expression index were evaluated respectively after the mice were sacrificed. Apoptosis of cancer cells was analyzed by FCM and electron microscopy scanning.Results  Compared with endostatin or VGEI151 gene alone treated group and combination treated group, growth of implanted gastric carcinoma was significantly reduced in size in mice treated with chimeric gene with an inhibition rate 88.11% versus 52.39%,44.37% and 75.02%, respectively.The MVD was decreased significantly in the Ad ENDO-VGEI151 treated group［（11.50±3.42）versus（35.18±4.15）,（34.37±2.72）and（21.49±2.74）］;VEGF165 expression was also decreased ［（31.58±4.06）% versus（58.74±7.64）%,（53.25±4.42）% and（43.15±4.57）%］;while apoptotic cells was obviously increased in the chimeric gene treated mice［（61.39±6.36）% versus（35.84±6.52）%,（39.69±5.24）and（45.50±7.64）%］.The percentage of apoptotic fresh cancer cells was also increased by FCM examination［ （16.04±4.07）% versus（3.15±1.17）%,（2.83±0.86）% and（7.15±2.15）%］.There was a synergistic benefit for the chimeric gene therapy of having stronger inhibitory effects than either endostatin, VGEI151 gene alone or combination group and this was statistical significance (P＜0.01).Conclusion  Ad ENDO-VGEI151 may have multiple effects leading to antiangiogenesis action. The fusion combine two potent angiostatic genes to increase the suppression of tumor angiogenesis,which may due to create conformational changes that enhance binding to receptors on endothelial cells and promote stability within the bloodtream.Fusion protein,operating through different mechanisms, deserves further attention.

　　【Key words】  gastric carcinoma；gene therapy；vascular endothelial growth inhibitor151

　　抗血管生成疗法作为肿瘤治疗的新兴策略受到关注，但已完成的血管生成抑制药物的临床试验结果却不十分令人满意。尽管存在试验设计和病例选择不当的问题，但血管生成抑制剂的活性不强和特异性不高的问题不容忽视。深入揭示肿瘤血管生成与生理性血管生成的差异；寻找更强力血管生成抑制药物将是抗血管生成疗法的研究重点［1］。通过基因工程方法对现有血管生成抑制剂加以改造，可以制造出活性更强、功能更全的药物分子或治疗基因［2］。有研究显示ENDO-VGEI151融合基因可以强烈抑制内皮细胞增殖，诱导凋亡；并能抑制胃癌细胞表达促血管生成因子；具有显著抑制血管生成及肿瘤生长的活性［3～5］，本研究旨在明确融合基因是否具有比单基因或联合基因更强的抑瘤活性。

　　1  资料与方法

　　1.1  材料  健康纯种SPF级4～6周龄Balb/c裸鼠购自第二军医大学实验动物中心，共48只，雌雄兼有，体重（20±3）g，在清洁级动物实验室饲养；胃癌SGC-7901细胞购自院细胞所。DMEM购自美国GIBCO公司；丙化碘锭（PI）购自Sigma公司；VEGF165免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司；鼠抗人Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体购自DAKO公司；细胞凋亡检测试剂盒购自Poster公司；SP免疫组化超敏试剂盒购自福州迈新生物公司。

　　1.2  重组腺病毒的制备  Ad ENDO-VGEI151和Ad LacZ的制备同前［4］；设计引物从pBV220 Endosatin中扩增ENDO基因，在5端引入HindⅢ酶切位点和IL3信号肽序列，3端引入BamHⅠ酶切位点得到609bp的IL3/ENDO片段。引物1：5-GCAAGCTTGCCACCATGAGCCGCCTGCCCGTCCT-GCTCCTGCTCCAACTCCTGGTCCGCCCCGGACTC-CAACACAGCCACCGCGAC-3；引物2：5-GCGGATCCCTACTTGGAGGCAGTCATGAAG-3。从pUC18 VGEI151扩增VGEI151片段在其5端引入HindⅢ酶切位点和IL3信号肽序列，3端引入BamHⅠ酶切位点得到510bp的IL3/VGEI151片段。引物3：5-GCAAGCTTGCCACCATGAGCCGCCTGCCCGTCCT-GCTCCTGCTCCAACTCCTGGTCCGCCCCGGACTC-CAACCAGTTGTGAGAC-3；引物4：5-GCGGATCCCTATAGTAAGAAGGCTCC-3。DNA自动测序证明序列正确。腺病毒载体pCA13用HindⅢ和BamHⅠ双酶切线性化，用HindⅢ/BamHⅠ将目的基因片段游离与线性化的pCA13连接，构建成pCA13 ENDO和pCA13 VGEI151。酶切鉴定连接和阅读框正确后，同源重组法包装出重组腺病毒Ad ENDO及Ad VGEI151，筛选鉴定后，扩增纯化，TCID50法测定滴度。

　　1.3  荷胃癌裸鼠模型建立、分组和  扩增人胃癌SGC-7901细胞，收获细胞调整细胞浓度为1×107个细胞/ml；取5×106个细胞/0.5ml注射于裸鼠颈部皮下。恒温、通风、无菌条件下饲养，接种5天后100%成瘤。随机编号用系统抽样法分为6组：PBS组、Ad LacZ组、Ad ENDO-VGEI151组、Ad ENDO组、Ad VGEI151组及Ad ENDO＋Ad VGEI151联合组，每组8只。接种后第5天起在瘤体内和瘤周用100μl微量注射器注射滴度为2×109pfu/ml的相应重组腺病毒500μl，每次选取不同方向进针各注入100μl；联合基因组用250μl Ad ENDO+250μl Ad VGEI151，隔天1次，并测肿瘤的最长径(a)和最短径(b)，共10次。

　　1.4  肿瘤标本的收集和检测  最末1次注射24h后，处死动物，解剖出瘤体，测肿瘤的最长径(a)和最短径(b)，按公式V=πab2/6瘤体积，称重。瘤体经生理盐水漂洗干净后，沿注射针道切取0.5g肿瘤组织制备单细胞悬液，PI单染法流式细胞仪检测活体肿瘤细胞生长周期；余瘤体一半用15%中性甲醛固定，常规病理切片，行苏木素-伊红染色、FⅧ因子、VEGF165免疫组织化学染色及TUNEL法凋亡染色；另一半快速切分成1cm3大小，以4%多聚甲醛固定，4℃冷藏，送电镜制片观察。微血管密度计数：200倍光镜视野下记数被抗Ⅷ因子抗体染成棕黄色的血管数目，结果用3个视野下的血管数目的平均数表示；癌细胞凋亡指数和VEGF165表达指数：在400倍高倍视野下，随机选取5个癌区，计算阳性细胞在全部癌细胞中所占的比例，取均值表示。

　　1.5  统计学方法  数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验或χ2检验。

　　2  结果

　　2.1  重组腺病毒的制备  目的基因PCR结果见图1。3种重组腺病毒载体酶谱分析见图2。用TCID50法测定病毒滴度约为4.2×1011 TCID50/ml。包装出的3种重组腺病毒经PCR鉴定证实目的基因存在。1.λDNA/ EocRⅠ+HindⅢ marker；2.647bp的IL3/ENDO-linker片段；3.476bp的linker-VEGI151片段；4.609bp的IL3/ENDO片段；5.510bp的IL3/VEGI151片断；6.Low DNA MassTM Ladder图1  目的基因PCR扩增电泳图

　　2.2  融合基因治疗对裸鼠种植胃癌生长的影响  融合基因治疗早期可以使肿瘤体积缩小（第3次治疗后平均体积从45.33mm3缩小为31.19mm3），治疗4次后融合基因组和各对照组肿瘤体积随种植时间延长都有所增加，但可明显发现融合基因组肿瘤增幅明显小于两单基因组和联合基因组，治疗结束时各组肿瘤体积差异更加明显（见图3）。分别计算各组抑瘤率（见表1），结果显示Ad ENDO-VGEI151明显抑制肿瘤生长，Ad LacZ影响轻微，说明疗效并非由于腺病毒载体所致，而是转染治疗基因发挥作用。Ad ENDO-VGEI151组、Ad ENDO组、Ad VGEI151组及Ad ENDO＋Ad VGEI151联合组的抑瘤效果均明显优于Ad LacZ组；融合基因治疗的效果又明显优于Ad ENDO和 Ad VGEI151单基因组及联合基因组（P＜0.01），而Ad LacZ组和PBS组之间差异无显著性（P＞0.05）。　1.λDNA/ EcoRⅠ+HindⅢ marker；2.pCA13 ENDO- VEGI151 ( 1114bp,6.95kb)；3.pCA13 ENDO(609bp,7.88kb)；4.pCA13 VEGI151(510bp,7.99kb)图2  3种重组腺病毒载体HindⅢ+BamⅠ双酶切鉴定图3  肿瘤细胞在裸鼠体内生长曲线表1  裸鼠种植瘤的体积和重量及抑瘤率 （略）注：与Ad LacZ组或PBS对照组比较，*P＜0.01；与Ad ENDO组、Ad VGEI151组或Ad ENDO＋Ad VGEI151联合组比较，▲P＜0.012.3  融合基因治疗对MVD、AI和VEGF165表达的影响  与Ad LacZ组和两单基因及联合基因组比较，融合基因组肿瘤组织MVD明显减少，凋亡细胞比例显著增加，VEGF165表达明显减少（见表2），组间差异均有非常显著性（P＜0.01）。表2  裸鼠肿瘤组织MVD、AI和VEGF165表达情况注：与Ad LacZ组或PBS对照组比较，*P＜0.01；与Ad ENDO组、Ad VGEI151组或Ad ENDO＋Ad VGEI151联合组比较，▲P＜0.01

　　2.4  融合基因治疗对活体肿瘤细胞增殖周期的影响  FCM检测显示融合基因组出现明显的凋亡峰，有16.04%的细胞出现凋亡（见图4），与单基因组或联合基因组相比差异均具有非常显著性（P＜0.01）；而G0～G1期、G2～M期及S期细胞比例各组间差异无显著性（P＞0.05）。

　　2.5  融合基因治疗对肿瘤细胞超微结构的影响  Ad LacZ组和对照组细胞无异常发现，在融合基因治疗组肿瘤组织中观察到典型的细胞凋亡形态，且凋亡细胞数目明显多于单基因和联合基因组。

　　3  讨论

　　大量的抗血管生成动物和临床实验结果证实联合应用不同机制的抗血管生成药物可以产生协同作用；从不同环节更强烈抑制新生血管形成和肿瘤生长，是提高抗血管生成疗效的重要方法［6，7］。作为联合治疗的替代和改进，融合基因治疗研究近年也受到关注。所谓血管生成融合基因疗法即应用基因工程技术将不同机制的血管生成抑制基因融合产生活性更强、功能更全、稳定性更高的新型治疗基因，对于增强疗效和简化治疗过程都十分有益［8，9］。国内有研究报道ENDO-VGEI151融合基因具有强烈的抗血管生成活性，但其与单基因和联合基因疗效的比较研究未见报道。本研究发现融合基因治疗组肿瘤的生长速度明显减慢，瘤体体积和重量明显低于两单基因和联合基因治疗组，在各时间点差异均有显著性（P＜0.01）；特别是在治疗早期可使肿瘤体积缩小。从抑瘤率分析，根据Webb分数乘积法计算Ad ENDO和Ad VGEI151理论相加效应（fa）联合=1-［1-（fa）Ad ENDO］ ［1-（fa）Ad VGEI151］为73.51％，联合组的抑瘤率为75.02％高于理论值，说明联合基因治疗的确具有协同作用。ENDO和VGEI151有各自独特的作用途径，联合治疗发挥协同作用属意料之中。但融合基因的抑瘤率为88.11%，高于联合基因的确切机制还有待进一步研究。目前推测可能由于：（1）融合蛋白可与内皮细胞表面的两种受体结合使其与内皮细胞的亲和力增加；（2）结构的改变使融合蛋白与其中任何一个受体更易结合；（3）融合后改变了其中一个蛋白的稳定性、活性或组织定位区使其活性增强；（4）融合蛋白封闭内皮细胞表面的肝素受体或整和素受体，阻断促血管生成因子结合。

　　总之，融合基因治疗为抗血管生成疗法提供了新思路，值得深入研究。另外融合基因治疗在早期可使肿瘤缩小提示，在肿瘤发生早期新生血管数目少、生成时相同步性高、发挥调控的血管生成因子有限是抗血管生成治疗的最佳时机，应用联合或融合基因治疗可以有效控制肿瘤生长甚至使肿瘤消退；而进入增殖期后肿瘤内血管数目激增，并且异时性和调控因子复杂性大大增加使治疗极为困难。因此，作为术后辅助治疗预防复发转移是抗血管生成疗法过渡到临床应用的最佳选择。

　　【】

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