三氧化二砷对MRL/lpr狼疮鼠基因甲基化的影响
作者：周艳 孙莉 陈丹 朱小春
【关键词】 三氧化二砷 MRL/lpr 狼疮鼠基因 甲基化
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是最常见、最严重的自身免疫性疾病之一，重症狼疮的效果目前仍不理想，因此，国内外学者都在寻求新的有效药物和新的治疗方法。三氧化二砷在临床上应用于白血病治疗已有多年，并有明显疗效。近年来有将三氧化二砷(ATO)用于狼疮鼠的治疗，取得了一定的疗效［１～３］。本研究应用动物实验观察ATO对SLE模型自身免疫及基因甲基化的影响，旨在探讨ATO在红斑狼疮中的治疗价值及其作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物的分组及处理 12周龄MRL/lpr小鼠24只(购自院上海实验动物中心，雌雄各半)，随机分为ATO组和生理盐水(NS)组，各12只，ATO组隔日腹腔注射ATO0.4 mg·kg-1·d-1，NS组隔日腹腔注射生理盐水，疗程60d。另将20只12周龄C57雄鼠随机分为ATO组和NS组，各10只，处理同上。
1.2 试剂、材料 三氧化二砷、鲑鱼精DNA及碱基标准品［腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、5-甲基胞嘧啶(5mC)及胸腺嘧啶(T)］购自Sigma公司，HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自北京中山生物科技公司，基因组DNA抽提试剂盒购自碧云天生物技术研究所，96孔酶标板购自Costar公司。
1.3 检测项目及方法 (1)抗dsDNA抗体水平测定［４］：ELISA方法测定用鲑鱼精DNA包被96孔酶标板，待测血清均作1:100稀释，结果在酶联免疫检测仪450nm处读出OD值。(2)DNA甲基化水平测定：DNA抽提及水解：使用试剂盒对各样品进行提取和纯化DNA，将约100μg基因组DNA和100μL氢氟酸混匀, 80℃水温育12h，然后于40℃烘箱至液体完全蒸发，随后加入0.02 mol/L，pH 2.3的NH4H2PO4 100μL；色谱条件及甲基化水平测定：Agilent1100高效液相色谱仪，色谱柱：25cm×4.6mm，5μm，Hypersil ODS C18反相色谱柱，柱温为20℃，以0.02 mol/L、pH2.3的NH4H2PO4为流动相，流速为1.2ml/min，检测波长为280nm，进样量为20μl，先用流动相平衡色谱柱至基线平稳，开始将5种碱基标准品：(A、G、C、5mC、T)分别进样，工作站软件处理后得出峰形和每种标准品的持留时间，即可确定各种碱基流出顺序，再将样品逐个进样，得出峰形和数据后根据C和5mC的峰下面积按公式DNA甲基化水平(%) = 5mC/(5mC+C)×100 %，求得DNA甲基化水平。(3)血常规测定：应用SYSMEX KX21对各组小鼠外周血进行检测。
1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件，资料用(x±s)表示，两样本均数比较采用t检验。以P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 MRL/lpr小鼠治疗前后抗dsDNA抗体水平的变化 在给药前ATO组和NS组的抗dsDNA抗体水平并无明显差异。治疗后ATO组小鼠的抗dsDNA抗体水平较NS组明显降低(P<0.01)。见表1。
表1 ATO对MRL/lpr小鼠治疗前后抗dsDNA抗体的影响（略）
注：与给药前比较，*P<0.01；与NS组比较，△P<0.01
2.2 治疗后两组MRL/lpr小鼠各脏器重量比较 实验结束时称取脾脏、胸腺、两侧腋窝及颈部淋巴结的重量。ATO组脾脏的重量较NS组明显减轻(P<0.05)。ATO组总淋巴结的重量较NS组也明显减轻(P<0.05)，而胸腺重量两组未见明显差异。见图1。
2.3 治疗后两组MRL/lpr小鼠DNA甲基化水平的比较 图2、3分别为ATO组和NS组小鼠脾脏DNA裂解后的高效液相图谱，图中基线平稳，可见清晰的5个吸收峰，按流出顺序分别为C、5mC、G、T、A。结果显示，ATO组脾脏DNA甲基化水平(3.78±0.81)%，NS组(2.16±0.42)%；ATO组淋巴结DNA甲基化水平(2.38±0.54)%，NS组(1.71±0.24)%，ATO组脾脏及淋巴结的DNA甲基化水平较NS组有明显的升高(P<0.05)，而血液与胸腺的甲基化水平两组相差不大(P>0.05)，见图4。
2.4 治疗后MRL/lpr、C57小鼠外周血细胞计数比较 在实验结束时测定四组小鼠的血常规，结果显示ATO治疗后MRL/lpr及C57小鼠的红细胞、白细胞、血红蛋白与NS组相比并无明显差异，而MRL/lpr小鼠ATO组血小板较NS组有明显升高(P<0.05)，见表2。
表2 ATO对MRL/lpr及C57小鼠血常规的影响（略）
注：与NS组比较，*P<0.05
3 讨论
MRL/lpr小鼠是常用的SLE动物模型之一，3月龄左右发病，发病后出现脾脏及全身淋巴结肿大，出现抗dsDNA抗体及免疫复合物相关性肾炎，临床和病理表现与人类SLE类似，为此，将其作为探索SLE 新治疗方法的实验对象。
抗dsDNA抗体是SLE重要的自身抗体之一，也是SLE活动的指标。本研究结果示MRL/lpr小鼠经ATO2个月后，血清抗dsDNA抗体水平比NS组明显下降(P<0.01)，故认为ATO能抑制MRL/lpr小鼠血清中抗dsDNA抗体的产生，从而控制狼疮的活动。
本研究发现，ATO组小鼠脾脏及淋巴结的重量较NS组明显降低，这与Bobé 等［１］的研究结果相同。全身淋巴结肿大为MRL/lpr小鼠发病的临床表现之一，亦是SLE疾病活动的表现。而淋巴结和脾脏均为重要的免疫器官，是发生免疫应答及合成免疫活性物质的重要场所。有研究已证实亚砷酸（ATO水溶液）能使BXSB狼疮鼠脾脏总T淋巴细胞减少［５］，因此推测ATO可能通过抑制狼疮鼠淋巴组织增生，从而减少体内自身抗体产生，使病情得到缓解。
SLE的发病机制至今仍不明确，近年有研究发现SLE患者普遍有基因组DNA甲基化水平降低，且SLE的活动程度与DNA甲基化水平呈负相关［６］。部分患者在接受肼苯达嗪等甲基化抑制剂治疗后发生狼疮样综合征。本实验结果显示ATO治疗后MRL/lpr小鼠脾脏及淋巴结的甲基化水平较NS组有明显升高。脾脏和淋巴结为主要的外周免疫器官，是T、B淋巴细胞居住的重要场所，也就是说ATO能提高外周T、B淋巴细胞的DNA甲基化水平。T细胞DNA低甲基化可以导致多种基因异常表达如干扰素(IFN)- γ［7］、白介素(IL)-4［8］等，而这些细胞因子在B细胞的激活及抗体的产生中均具有重要的作用。以往实验已证实ATO能抑制BXSB小鼠脾IFN-γ的表达［3］，在体外ATO还能抑制MRL/lpr小鼠CD4+T细胞IFN-γ和IL-4的表达，且有报道，IFN-γ和IL-4基因启动子低甲基化是导致两者转录表达升高的主要机制。回顾近几年的研究，发现ATO能促进bcl-2基因启动子和Caco-2细胞基因组DNA的高甲基化，且甲基化程度与砷的剂量呈正相关，提示砷剂能通过改变DNA甲基化水平来调控着某些基因的转录。因此作者推论ATO可能主要通过提高基因甲基化水平，而减少狼疮小鼠体内多种与免疫激活有关的细胞因子的表达，从而达到抑制免疫与缓解SLE的病情。
砷剂应用于临床后，人们对其安全性方面关注较多。本实验中观察到治疗期间ATO组MRL/lpr及C57小鼠体重、食量、毛色、活动情况均较NS组无明显差异，治疗后两组MRL/lpr及C57小鼠的外周血白细胞、红细胞等数值均无明显差异。由此认为，治疗剂量的ATO在SLE诱导期治疗2个月是安全的。
综上所述，ATO能提高MRL/lpr小鼠的脾脏与淋巴结DNA甲基化水平，降低其血清抗dsDNA水平并抑制淋巴组织的增生，显示ATO对SLE具有一定的治疗作用。据此推测ATO可能通过对提高基因的甲基化水平，抑制IFN-γ、IL-4等相关基因的表达，从而达到抑制机体免疫的功能。本实验中明确了各器官DNA甲基化的整体水平，但ATO是否是通过改变IFN-γ、IL-4等因子启动子的甲基化及通过何种机制改变基因甲基化水平，仍需今后进一步研究。
【】
1 Bobé P,Bonardelle D.Arsenic trioxide: A promising novel therapeutic agent for lymphoproliferative and autoimmune syndromes in MRL/lpr mice.Blood，2006, 108(13):3967～3975.
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3 朱小春，金晓冬，黄朝兴，等．三氧化二砷对BXSB自发狼疮鼠血清自身抗体与肾小球免疫球蛋白沉着的影响．中华内科杂志,2001,40(11): 764～765.
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