结核性腹膜炎和肝癌患者的腹水与血清趋化因子测定及其意义

【摘要】  目的 研究结核性腹膜炎，肝癌所引起的腹水和腹水中趋化因子—调节活化正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)和基质细胞衍生因子（SDF-1），以及它们的受体CCR3和CXCR4的表达水平及临床意义。 方法 用酶联免疫吸附法(ELISA) 和流式细胞仪（FCM）测定16例结核性腹膜炎，39例肝癌患者以及正常对照20例血清和/或腹水中RANTES、SDF-1和受体CCR3、CXCR4的水平。 结果 结核性腹膜炎血清及腹水中SDF-1以及CXCR4升高，而肝癌患者血清及腹水中RANTES以及受体CCR3水平上升。结论 趋化因子在腹部结核和肿瘤时会出现不同性质T细胞免疫应答，为以后的应用奠定实验基础。

【关键词】  调节活化正常T细胞表达和分泌因子 基质细胞衍生因子-1 受体 腹水

　　【Abstract】  Objective  The expression of regulated on activation normal T cell expressed and secreted(RANTES), stromal cell-derived factor-1(SDF-1) and their receptors CCR3 and CXCR4  in patients with tuberculous peritonitis and hepatocellular carcinoma were analyzed．so as  to find out the role of chemeokines and their receptors in the pathophysiologieal process of tuberculous and malignant effusion. Methods  The concentration of RANTES，SDF-1 in serum and ascites samples from 16 tuberculous peritonitis and 39 hepatocellular carcinoma patients were determined by enzyme-labeled immunerbent assay(ELISA) and were compare with healthy donors, their receptor CCR3, CXCR4 were analysed by flow cytometer. Results  Levels of SDF-1 and CXCR4 protein in both serum and ascites in patients with tuberculous peritonitis were significantly increased.However, the expression of RANTES and CCR3 were markedly higher in hepatocellular carcinoma patients than those in tuberculous ascites. Conclusions  chemeokines and receptors play a different T cell's immune response role in tuberculous and malignant ascites.

　　【Key Words】  Activation normal T cell expressed and secreted  Stromal cell-derived factor-1  Receptor  Ascites

    在各种原因引起的腹膜疾病中，由细胞因子介导的细胞免疫起到重要作用。调节活化正常T细胞表达和分泌因子(regulated on activation normal T cell expressed and secreted，RANTES)及SDF-1 (stromal cell-derived factor-1)均为炎症性趋化因子，具有调节T淋巴细胞分化的功能。在炎症条件下，RANTES和SDF -1增多，同时RANTES与其受体CCR3，SDF-1与其受体CXCR4进一步相互激活，能募集很多包括活化的效应T淋巴细胞进入组织的炎症损伤部位发挥免疫应答功能［１，２］。作者对结核性和恶性肿瘤腹水及血清中趋化因子含量进行检测，旨在探讨它们在腹水中的作用及意义。

　　1  临床资料

　　1.1  一般资料 

　　本院39例肝癌(A组)，16例结核性腹膜炎患者(B组)，均有中到大量腹水。正常对照组20例(C组)为健康成年人。各组的年龄、性别无差异（数据未显示）。患者标本取自外周血和腹水，C组取自外周血。

　　1.2  标本收集 

　　抽取空腹外周静脉血5ml，或者腹水5 ml。以2500r/min离心15min，取上清，置于－20℃备检。

　　1.3  RANTES及SDF-1的检测方法 

　　RANTES及SDF-1的检测采用酶联免疫吸附试验（ELISA），操作按照R&D试剂盒( RNATES cat#DY278，SDF-1 cat#DY279)说明书进行。

　　1.4  腹水单个核细胞和外周血单个核细胞（PBMC）的分离 

　　取肝素抗凝(10 U／ml)的腹水 (经透明质酸酶10 U／ml 37℃处理30 min)或外周血10 ml，采用淋巴细胞分离液按密度梯度离心法分离SFMC或PBMC，并以含10％胎牛血清(FCS)的RPMl1640培养液调整细胞密度为2×l06/L。

　　1.5  T细胞上CCR3和CXCR4表达的流式细胞术分析 

　　用Becton Dickinson流式细胞仪，按试剂盒操作说明书操作。

　　1.6  统计学处理

　　数据以(x±s)表示，两组间比较采用SPSS 11.0 统计软件作t检验。P<0.05判断为有显著性差异。

　　2  结果

　　2.1  结核性腹膜炎、肝癌患者和正常人SDF-1的表达 

　　结核性腹膜炎和肝癌患者的外周血SDF-1表达较正常人升高（但无统计学差异，P＞0.05）,结核性腹膜炎和肝癌患者之间也无统计学差异（P＞0.05）

    在腹水SDF-1检测中，结核性腹膜炎患者的SDF-1表达比同组的血清表达明显升高（P＜0.05）。而肝癌患者的表达与同组的血清SDF-1表达相接近（P＞0.05）。而且腹水的SDF-1表达，结核性腹膜炎较肝癌患者明显升高（P＜0.05）。见表1。

　　2.2  结核性腹膜炎、肝癌患者和正常人RANTES水平的比较 

　　肝癌患者的外周血RANTES水平较结核性腹膜炎和正常人升高（但无统计学差异，P＞0.05）,而结核性腹膜炎和正常组之间相接近（P＞0.05）。在腹水RANTES水平检测中，结核性腹膜炎患者的RANTES表达与同组的血清表达接近（P＞0.05）。而肝癌患者的表达与同组的血清SDF-1表达明显升高（P＜0.05）。而且腹水的RANTES表达，肝癌较结核性腹膜炎患者明显升高（P＜0.05）。具体见表1。表1  血清及腹水RANTES、SDF-1的水平（略）

　　2.3  CCR3和CXCR4的表达 

　　正常人及结核性腹膜炎、肝癌患者的PBMC，以及结核性腹膜炎、肝癌患者的腹水单个核细胞上均能测到CCR3及CXCR4的表达。结果显示，肝癌患者的PBMC上CCR3表达明显高于正常人和结核性腹膜炎（P<0.05），而正常人和结核性腹膜炎的CCR3表达无明显差异（P＞0.05）。而且肝癌患者的腹水单个核细胞CCR3表达也比同组PBMC高，比结核性腹膜炎的CCR3表达也高（P<0.05）。而CXCR的表达正好相反，结核性腹膜炎的CXCR4表达较正常组和肝癌患者明显增高（P<0.05）。见表2。表2  血清及腹水T细胞CCR3和CXCR4的表达水平（略）注：同组内与血清水平比较，*P<0.05

　　3  讨论

    结核性腹膜炎和肝癌是引起腹腔积液的主要原因。结核病是一种由结核分枝杆菌引起的以干酪样坏死和肉芽组织增生为特征的慢性感染性疾病，感染结核杆菌后宿主的抗结核免疫机制相当复杂，其中涉及多种细胞因子的参与，而肝癌所引起的机体抗肿瘤以及肿瘤“免疫逃逸”的机制更加复杂。本文从Thl和Th2细胞的重要调节因子—趋化因子的角度出发，分析在结核和肝癌患者腹水中的两种趋化因子以及受体的表达不同，从而揭示两者不同的免疫机制。

    T细胞应答的中心过程是T细胞向Th1型或Th2型分化。T细胞致敏阶段细胞因子的不同组合决定了效应T细胞所产生的细胞因子的类型。作为Th1、Th2不同效应能力的一部分，它们可能表达不同的趋化因子受体，使得它们向不同组织趋化。趋化因子吸引免疫细胞到局部参与免疫调节和免疫病理反应。趋化因子特异吸引CD4+/CDRO45+ T 细胞进入某些特定部位，在腹水的发生形成中起着极为重要的作用［３］。RANTES介导免疫过程与其受体CCR3在内皮细胞上的表达密切相关。CCR3是嗜酸粒细胞趋化因子（eotaxin）、eotaxin2、RANTES、MCP-2，-3，-4的受体，最初在嗜酸／嗜碱细胞中发现。Th2细胞能选择性地表达CCR3，体外分化的Th2细胞系也能表达CCR3，但Th1则未见表达。此外，不论CD4＋还是CD8＋T细胞群，CCR3＋细胞组分与生成IL-4的细胞数均相近［４］。因此，CCR3＋的T细胞可以产生IL-4，而生成IL-4是Th2细胞的重要特征。

    基质细胞衍生因子-1(SDF-1)是趋化因子CXC亚家族的重要成员之一，SDF-1主要表达在慢性炎症组织如银屑病皮肤和风湿病滑膜，通过与其受体CXCR4的结合趋化内皮细胞而参与血管形成过程。现有的研究表明，SDF-1与CXCR4所构成的受配体系统在肿瘤的免疫反应中起重要作用。CXCR4可作为Thl细胞更稳定的标志，调节许多Thl细胞因子，如IFN-γ，IL-2，IL-12等的分泌［５］。

    机体感染结核杆菌后激活辅助性T细胞，而且以Thl型反应为主，Thl细胞因参与的迟发型变态反应是结核性胸膜炎产生机制之一。有研究显示，结核性胸腔积液中IFN-γ水平显著高于恶性胸腔积液。表明体内CD4 T细胞处于激活状态，结核性积液中的IFN-γ，IL-2，IL-12表达上调提示结核性胸膜炎的局部免疫反应活跃［６］。Thl细胞因子参与胸膜局部免疫反应，IL-2、IL-12促进分裂原等刺激T细胞的分化增殖，促使Th0向Thl细胞转化，产生IFN-γ，IL-2，IL-12等Thl细胞因子。

    SDF-1与其受体CXCR4是Thl细胞因子的重要调节因子,本文的实验结果与报道相符。由于Th2细胞上选择性地表达CCR3，CCR3的T细胞产生Th2细胞因子，RANTES与受体CCR3相互作用，在调节Th2细胞因子方面发挥重要作用。肿瘤组织多分泌Th2类细胞因子，机体处于Th2细胞因子优势状态是肿瘤免疫逃逸的机制之一。故作者认为，RANTES以及受体CCR3的表达升高，可能与Th2细胞因子的升高以及肿瘤免疫逃逸有关。有报道认为，恶性胸腔积液Thl细胞因子水平低于结核性胸膜炎，表明恶性胸腔积液的局部Thl免疫应答比结核性胸腔积液低［７］。本文在腹水中的SDF-1与其受体CXCR4较肝癌组表达低，似乎也可以佐证上述观点。在恶性肿瘤患者体内，内源性的Thl细胞因子产生能力及肿瘤细胞对Thl细胞因子的反应能力常显著下降，是导致病情进一步恶化、浸润和转移的重要因素。

    趋化因子在炎症中的研究比较深入，而在结核和肝癌腹水中的研究国内尚未见报道。目前认为，一个迁移细胞在其移行的不同特定阶段可能表达不同的趋化因子受体、对不同的趋化因子有反应；因此，如果阻断趋化因子受体则会导致迁移细胞迷失方向，不能到达其最终目标。故拮抗趋化因子受体的将比现有疗法更具选择性，产生更少的免疫抑制副作用［８］。目前，已生产的趋化因子受体拮抗剂多种多样，包括单克隆抗体，趋化因子修饰物以及最近研制的小分子无机物。在未来的几年中，它们很可能成为治疗肿瘤和变态反应疾病的有效药物。本研究为以后趋化因子的应用奠定了实验基础。

【文献】
  　　1 Klimiuk PA, Sierakowski S, Latosiewicz R, et al. Histological patterns of synovitis and serum chemokines in patients with rheumatoid arthritis. J Rheumatol, 2005, 32(9):1666～1672.

　　2 Hirokazu Tamamura，Miho Fujisawa，Kenichi Hiramatsu,et al.Identification of a CXCR4 antagonist, T140 analog, as an anti-rheumatoid arthritis agent. FEBS Letters 569 (2004) 99～104.

　　3 Hosaka S, Akahoshi T, Wada C, et al . Expression of the chemokine superfamily in rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol ,1994 ,97(3) :451～457.

　　4 Matthias Mack, Hilke Bruhl, Rudi Gruber, et al. Predominance of mononuclear cells expressing the chemokine receptor CCR3 in synovial effusions of patients with different from of arthritis. Arthritis Rheum, 1999(5), 42:981～988.

　　5 A ,Yoshie O. Chemokines :a new classification system and their role in immunity. Immunity, 2000, 12(2):121～127.

　　6 Shimokata K．Tuberculous infection and biological response in nm．Kekkaku，2004，79(9)：541～554.

　　7 Okamoto M ，Kawabe T，1wasald Y，et a1．Evuathn of interferongamma，interfemn gamma inclucing cytokines，and interferon. gammaindudble chnokines in tuberculous pleural effusions．J Lab Clin Med，2005，145(2)：88～89.

　　8 Schrader AJ，Lechner O，Templin M，et al．CXCR4／CXCLI 2 expression and signalling in kindney cancer．Br J Cancer，2002，86：1250～l256.