器官移植受者微量CMV DNA与IL-10基因单核苷酸多态性的相关性研究
作者：傅晶 郑建建 潘晓东 杨亦荣 陈必成 郑少玲
【摘要】 目的 研究白介素-10（IL-10）基因G1082A和C819T单核苷酸多态性（SNP）与移植术后外周血微量巨细胞病毒（CMV）DNA的关系。方法 采集176例移植术后受者，429例次的外周血。通过巢式聚合酶链反应（nPCR）技术检测微量CMV DNA。通过序列特异性聚合酶链反应（SSP-PCR）技术检测IL-10基因G1082A与C819T的变异情况。分析IL-10各基因型在微量CMV DNA受者中的分布频率，并对阳性组与阴性组进行比较。结果 研究人群中IL-10 G1082A和C819T基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。CMV DNA阳性组IL-10 G1082A和C819T等位基因频率分别为G=3.75%、A=96.25%和C=32.50%、T=67.50%；CMV DNA阴性组分别为G=5.51%、A=94.49%和C=36.03%、T=63.97%。CMV DNA阳性组两SNP基因型及等位基因分布与其在CMV DNA阴性组中的分布差异无显著性（P>0.05）。结论 目前尚不能认为IL-10基因G1082A与C819T单核苷酸多态性与移植受者微量CMV DNA阳性有相关性。
【关键词】 白介素-10 单核苷酸多态性 移植 巨细胞病毒
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the IL-10 G1082A and C819T 's SNP and the trace CMV DNA of recipients. Methods The trace CMV DNA in 429 samples of 176 patients was detected by nested polymerase chain reaction (nPCR). The IL-10 G1082A and C819T's SNP were determined using sequence specific primers polymerase chain reaction (SSP-PCR). Results In the 40 CMV DNA-positive samples, the G1082A allele frequencies were 3.75% for G and 96.25% for A, with the genotype frequencies 0% for G/G, 92.5% (n=37) for A/A, and 7.5% (n=3) for G/A; In the 136 CMV DNA-negative samples, the G1082A allele frequencies were 5.51% for G and 94.49% for A, with the genotype frequencies 0% for G/G, 88.97% (n=121) for A/A, and 11.03% (n=15) for G/A. In the CMV DNA-positive group, the C819T allele frequencies were 32.5% for C and 67.5% for T, with the genotype frequencies 5% (n=2) for C/C, 40% (n=16) for T/T, and 55% (n=22) for C/T; In the CMV DNA-negative group, the IL-10 C819T allele frequencies were 36.03% for C and 63.97% for T, with the genotype frequencies 11.76% (n=16) for C/C, 39.71% (n=54) for T/T, and 48.53% (n=66) for C/T. The two SNPs distribution of the frequencies were all statistically similar between the CMV DNA-positive/negative groups（P>0.05）. Conclusions The IL-10 gene G1082A and C819T's SNP are not associated with the CMV DNA -positive recipients.
【Key words】 Interleukin 10 single nucleotide polymorphism(SNP) transplantation Cytomegalovirus(CMV)
IL-10具有抗炎和免疫调节作用，亦可通过调节其他细胞因子而发挥作用。其中免疫抑制效应是IL-10的主要生物学作用之一。目前发现位于IL-10基因启动子区域中G-1082A、C-819T、C-592A基因的单核苷酸多态性（SNP）与移植免疫状态关系密切。本研究根据CMV的潜伏感染特点，尝试以外周血微量CMV DNA作为评价免疫抑制状态的靶分子，探讨IL-10基因G1082A与C819T单核苷酸多态性与温州地区5年来器官移植受者微量CMV DNA阳性的关系。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 免疫抑制药物浓度检测 受者的免疫抑制方案均以他克莫司（FK506）为主。服药前，抽取静脉血测全血FK506浓度谷值。FK506浓度采用微粒子酶免疫分析技术测定。
1.2 方法 连续收集2007年6至9月肝、肾移植术后来本院随访者FK506浓度检测血标本，共176例受者，429例次。被检受者术后已随访6～30个月，术前CMVpp65抗原检测均阴性。男130例，女46例；平均年龄(44.80±11.21)岁。根据CMV DNA检测将其分为阳性组和阴性组。其中107例受者多次检测，当出现CMV DNA阳性时即将其列为阳性组。阳性组中，对于多次检测的受者，FK506浓度取CMV DNA阳性时所对应浓度的平均值；阴性组则为各浓度的平均值。
1.3 DNA提取 取FK506浓度检测血标本全血300μl，破红细胞后，裂解白细胞，沉淀蛋白质，然后予异丙醇析出DNA，最后加入100μl DNA水合液，75℃水浴10min，-20℃保存备用。
1.4 核酸扩增 (1）巢式聚合酶链反应（nPCR）技术检测微量CMV DNA：根据CMV病毒基因组设计引物，第1次PCR扩增引物分别为P1 5'TCTAAGACATAGCAGCACAGCACC 3'、P2 5'TGAAAAAATATACCCAGACGGAAG 3'；第2次PCR扩增引物分别为P3 5'AGCACCCGACAGAACTCACT 3'、P4 5'TATGGCTTATGCCCAGAAAA 3'。 取1.5μl DNA用于15μl的 PCR体系，其中包括：15mM Tris-HCl(pH 8.3)、 75mM KCl、 3mM MgCl2、1.5mM dNTP 、0.675U Taq polymerase、0.15μM引物、5％甘油。第1次PCR反应条件为经过94℃预变性2min后，94℃变性20s，58℃退火60s，72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃延伸2min。完成后取1.5μl PCR产物用于第2次扩增，经过94℃预变性2min后，进行25个循环，94℃变性10s,55℃退火30s，72℃延伸30s，最后进行72℃ 延伸2min。取10μl PCR最终产物，2％的琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪观察，并判断结果。(2) 序列特异性聚合酶链反应（SSP-PCR）技术检测IL-10基因G1082A与C819T的变异情况，根据报道的方法进行［１］。
1.5 DNA测序 根据SSP-PCR的结果，选择出各种基因型DNA，用测序引物进行PCR并对PCR产物进行纯化。产物由上海Invitrogen生物技术有限公司进行测序。
1.6 统计学处理 基因型频率和基因频率采用基因计数法，并进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验。分别对CMV DNA阳性、阴性两组中IL-10 G1082A与C819T基因分布情况进行χ2检验。对CMV DNA阳性、阴性两组的FK506药物浓度进行t检验。
2 结果
2.1 基因型判定 根据序列特异性引物扩增出现的阳性条带判定为具有相同的IL-10 G1082A或C819T的基因型。SSP-PCR测定结果与测序结果比较发现符合率达100％。
2.2 CMV DNA 检测 176例移植受者中，CMV DNA阳性受者40例，检出率22.73%（所有DNA标本仅行一次nPCR检测）。其中28例受者随药物浓度变化出现CMV DNA阳性、阴性间的转变。低药物浓度（<3ng/ml）受者亦发现CMV DNA阳性6例。
2.3 IL-10 SNP频率及分布情况 研究人群中两SNP基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。176例移植受者IL-10基因G1082A、基因频率及基型分布见表1。176例移植受者IL-10基因C819T基因频率及基型分布见表2。阳性组与阴性组的比较发现两SNP基因频率及基因型的分布均出现相似的情况。两组受者药物浓度比较：CMV DNA阳性、阴性两组的FK506药物浓度差异无显著性。［（5.90±4.09）ng/ml vs（6.23±3.44）ng/ml；P>0.05］。
表1 176例移植受者IL-10 基因G1082A基因频率及基因型分布（略）
注：基因型χ2=0.123，双侧P>0.05；基因G、A χ2=0，双侧P>0.05
表2 176例移植受者IL-10 基因C819T基因频率及基因型分布（略）
注：基因型χ2=1.643，双侧P>0.05；基因C、T χ2=0，双侧P>0.05
3 讨论
器官移植是目前终末期脏器病变的最有效手段。但是大剂量免疫抑制剂的长期使用，使受者更易于感染［２］，同时也给受者及社会带来较大的负担。而解决这些问题的最佳方法是寻找一个能综合反映个体细胞免疫状态的指标。目前国际、国内尚无比较客观的指标来评价机体的免疫状态。CMV是免疫抑制受者最易感染的病原体之一。国人CMV IgG阳性率接近100％，世界范围内亦有约50％～100％的感染率。其主要原因是CMV在初次感染产生免疫应答后，还可在体内潜伏感染。CMV可潜伏于感染者的外周血白细胞中，当细胞免疫下降时CMV可再次激活，CMV DNA出现增殖。敏感的nPCR可检测到极微量CMV DNA。在潜伏感染状态下，采用nPCR方法检查，健康个体外周血中极少出现微量CMV DNA（0.2%）［３，４］。本研究对176例移植术后服用FK506受者nPCR检测，发现22.73％在其外周血中可检测到CMV DNA。其中对107例受者连续多次采集外周血标本行nPCR检测，发现当FK506浓度升高时CMV DNA阳性率亦增加，可出现伴随药物浓度的升降而出现CMV DNA阳性、阴性的动态变化。故认为微量CMV DNA间接反应了免疫抑制程度，可以用来作为评价免疫状态的指标。作者同时也发现在那些移植术后已随访较长时间，FK506浓度相对稳定，且较低的受者中尚有微量CMV DNA存在，提示其它因素如其它免疫抑制剂的应用、遗传因素等也影响个体免疫状态。本研究以外周血微量CMV DNA作为评价免疫抑制状态的靶分子，探讨具有免疫抑制效应的IL-10与移植术后个体免疫状态的相关性。
【】
1 Hai LQ,Qiang W,Na Gao,et al. Association of IL-10 level and IL-10 promoter SNPs with specific antibodies in penicillin-allergic patients. Eur J Clin Pharmacol,2007,63:263～269.
2 何永春，黄洪锋. 肾移植术后肺部CMV感染的临床特点及治疗对策.浙江临床医学杂志，2002,4(2):92～93.
3 Roback JD, Drew WL, Laycock ME,et al. CMV DNA is rarely detected in healthy blood donors using validated PCR assays. Transfusion , 2003 , 43:314～321.
4 Greenlee DJ, Fan H, Lawless K, et al. Quantitation of CMV by real-time PCR in transfusable RBC units. Transfusion , 2002 , 42:403～408.
5 Argiris A, David S, Phil D，et al . Association of polymorphisms in the human interferon-γ and interleukin-10 gene with acute and chronic kidney transplant outcome.Transplantation,2001,71(5):674～678.
6 Lowe PR，Galley HF , Abdel-Fattah A , et al . Influence of interleukin-10 polymorphisms on interleukin-10 expression and survival in critically ill patients. Crit Care Med , 2003 ,31 :34.
7 Kuzushita N, Hayashi N, Katayama K, et al. High levels of serum interleukin-10 are associated with a poor response to interferon treatment in patients with chronic hepatitis C. Scand J Gast roenterol,1997,32(2):169～174.
