微波对骨细胞活力和生物力学的影响
作者：李新春 杜靖远 毛宾尧
【摘要】 目的 研究微波辐射对大鼠股骨细胞活力和生物力学的影响，以探求杀灭所有骨、软骨细胞时骨组织生物力学的变化。 方法 32只大鼠处死后，将其双侧股骨完整取出，左侧股骨为实验组，右侧股骨为对照组。应用微波对实验组股骨分别加热3、5、10、15min后，用特殊的乳酸脱氢酶活性染色，判断骨、软骨细胞的活力；用Instron万能材料试验机测定股骨的生物力学并同步记录；用原子吸收分光光度仪测定股骨钙的含量。 结果 实验组与对照组的生物力学及钙含量差异无显著性（P>0.05），股骨经微波加热10min后，温度可达62℃，能够杀灭骨、软骨所有的活细胞。 结论 微波产生的高温，在较短的时间内能杀灭骨、软骨活细胞，而对骨的生物力学无显著损害；通过组织化学观察乳酸脱氢酶活性判断骨、软骨细胞活力的方法是特异和敏感的，体外微波加热可应用于骨肿瘤的保肢手术。
【关键词】 微波 细胞活力 生物力学 骨 乳酸脱氢酶
【Abstract】Objective To investigate the effects of microwave induced hyperthermia on cell viability and biomechanics of bone cells in rat's femur. The biomechanics varieties of rat's femur after complete eradication of all viable cells in rat bone were studied. Methods 32 rats were euthanized and femurs were removed by disarticulated. The left femurs were heated for 3 minutes, 5 minutes, 10 minutes and 15 minutes with the microwave and the histochemical assay for special lactate dehydrogenase activity was evaluated. The rat bone's biomechanics and the content of calcium tests were carried out. The right femurs were taken as control. Results There was no significant difference in rat bone biomechanics and the content of calcium between both groups (p>0.05) and complete cell death occurred after 10 minutes of heating at 62℃. Conclusion It was found that complete eradication of all viable cells in rats bone could be achieved with minimal reduction mechanical function in shorter time by microwave induced hyperthermia. The method to determine osteocyte's viability by histochemical assay for lactate dehydrogenase activity proves to be sensitive and specific. Microwave may be applied in limb salvage surgery on patients of bone tumor.
【Key words】Microwave Cell viability Biomechanics Bone Lactate dehydrogenase
本研究旨在探讨微波加热对骨、软骨细胞活力及骨组织生物力学的影响，最终为临床提供理想的骨肿瘤区段处理方法。
1 材料和方法
1.1 取材及实验分组
32只8周龄健康雄性Wister大鼠（山东大学动物中心提供），体重180～300g，处死后行关节离断，完整取出股骨，仔细分离去除软组织(不损伤骨表面)，自中点用电锯横断一分为二（为使温度计探针能进入髓腔内），用生理盐水冲洗血液及髓内组织后，放入生理盐水中备用。左侧股骨为实验组，右侧股骨为对照组（除不加热外，其余过程同实验组）。
1.2 微波加热
将左侧的64块半股骨随机分为Ⅰ～Ⅳ组，每组16块，各组的加热时间分别为3、5、10，15min。加热方法：（1）预加热试验：将Ⅰ～Ⅳ组骨块，每组随机取出2块，共8块放入100×15mm的培养皿中，加入40ml生理盐水将其浸没，用2450MHz微波机（WE2102-A，北京产）加热，输出功率调为160W，将带探头的热电偶测温计置入髓腔内测温并记录，加热时间分别为3、5、10、15min，每次加热循环5次，求出平均温度及标准差；（2）加热试验：将每组骨块（14块）放入上述培养皿中，加入等量的盐水后加热，所用仪器同预加热试验，Ⅰ～Ⅳ组的加热时间分别为3、5、10、15min，加热后骨块分别放入盛盐水的烧杯中，加热时间与温度关系如图1所示。
1.3 骨、软骨细胞的活力测定
将Ⅰ～Ⅳ组加热的骨块，用微型电锯装微薄金刚刀片，冠状面纵行将其切割为二，同时纵行切取2片厚150～200μm的骨片（包括关节软骨、干骺端、骺板及骨干）。将骨片用聚硅磨石磨至75～100μm厚。在整个切割及制作骨磨片过程中均用冷生理盐水（0℃～４℃）持续冲洗。制作的骨磨片用生理盐水冲洗后，浸入10％EDTA脱钙，4℃脱钙18h，按照Wong等［１］所述的染色并根据硝基蓝四唑反应判断乳酸脱氢酶活性，进而确定加热后各组骨、软骨细胞的活力，在细胞浆内出现蓝色颗粒证明细胞有活力［１］。染色：孵育介质包括磷酸盐缓冲液(PH7.2，2.5mmol·L-1)、乳酸锂(50mmol·L-1)、氰化钾(10mmol·L-1)、氯化钾(5mmol·L-1)、硝基蓝四唑（Nitroble tetrazolium , NBT）, 0.6mmol·L-1(Sigma公司)；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶I，NAD）10mmol·L-1(Sigma公司)；配制30ml孵育液，pH浓度用0.1mmol·L-1氢氧化钠调整至7.2，将脱钙后的骨磨片放在新鲜配制的孵育液中37℃孵育4h。封固：骨磨片取出后，10%甲醛溶液固定，梯度乙醇脱水，载玻片封固后，在光镜下观察。
1.4 生物力学试验
将半圆柱形股骨应用三点弯曲试验在Instron（1122型，英国）万能材料实验机上测试。两横梁间距调为14mm，加载速度0.1mm·min-1，以100N为等级加载，同步绘出载荷-变形曲线。
1.5 钙含量
将股骨称重，用6N·L-1盐酸消化，用原子吸收分光光度仪（Au2700, OLYMPUS, Japan）测定钙含量。钙液体试剂盒购于北京中生生物工程高技术公司。单位重量标本含钙量（μg·mg-1）。
1.6 统计学分析
采用SPLM统计分析软件应用Wilcoxon配对检验，以(x±s)表示。以P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 骨、软骨细胞的活力
按照Liebergall标准分为三种［２］：（1）细胞存活：组织磨片中细胞胞浆蓝色颗粒＞50%；（2）部分存活：细胞胞浆中蓝色颗粒＜50%；（3）细胞死亡：胞浆内无蓝色颗粒。对照组在四个部位的所有细胞均存活。具体结果见表1。从表1可说明此染色方法是特异和敏感的，同时表示组织学分析标本的制备过程对细胞活力没有相反的作用。表1 微波加热后大鼠股骨细胞活力的变化（略）
2.2 生物力学
大鼠股骨最大载荷（N）、刚度（N/mm）、最大变形量（mm）见表2。实验组与对照组的力学特征无重大改变（P>0.05）。加热15min后，最大载荷及刚度较对照组减小，但差异无显著性（P>0.05）。表2 微波加热后对大鼠股骨生物力学变化(略)
2.3 钙含量
两组钙含量差异无显著性（P>0.05），说明微波在较短时间和相对较低温度下，对骨的主要成分羟基磷灰石破坏作用不强烈。
3 讨论
微波通过激活物质中分子的双极，使分子在物质内部碰撞而产生热量；微波对骨组织的加热较通过传导和对流热传递的传统水浴加热具有加热快速、高效的特点。微波直接作用于骨组织中的水分子，使细胞加热，所以便在较短的时间和相对较低的温度下使大鼠股骨所有细胞死亡，通过水浴加热至60℃需30min［３］，而微波仅需10min。本研究应用微波加热10min完全杀死骨、软骨活的细胞而对骨的最大载荷、刚度、最大位移及骨钙含量无显著性影响，说明微波可以在破坏非结构蛋白及羟基磷灰石前杀死骨、软骨的细胞而股骨仍能保持正常的生物力学性能，此法明显优于高压灭菌法对骨组织的处理［４，5］。
瘤段骨理想的处理方式是除去所有肿瘤细胞，最大限度地保持其生物力学及生物学特性。加热时对骨细胞活力的影响，有些学者应用温度作为评估骨细胞活力的参数，通过外部温度测量判断细胞的死亡［6］。这种方法没有考虑到骨组织是特别复杂和非均一的物质。尽管湿骨的骨皮质及骨小梁具有相似的热传导和弥散，但它们不同的相对百分比和几何分布可影响骨组织内的热介质，因此骨内各部位抗热效果是不相同的，在某一温度下，有些区域的细胞被杀死，而某些区域由于抗热较强而致此区域温度较低细胞不能全部被杀死，所以对一定形状与大小的骨没有实验证实的标准骨传导，仅靠温度是不能判断细胞的活力。本实验应用组织化学检测乳酸脱氢酶活性进而判断骨、软骨细胞的活力，对照组在四个部位细胞均存活，乳酸脱氢酶活性为阳性，而经水浴加热法处理的骨标本或经微波加热10min，温度达62℃后，骨、软骨细胞均被杀死，乳酸脱氢酶活性为阴性，说明此方法是敏感和特异的［３］；同时发现软骨有相对较强的抗热作用，这有待进一步研究。
骨传导和骨诱导是骨独特的性质，在骨的修复与愈合中起着重要作用，特别是骨诱导性，因此在加热时要尽可能保护骨内的各种生物活性因子。微波在相对较低的温度和较短时间内杀灭所有骨、软骨细胞对骨的生物力学无显著损害，应用乳酸脱氢酶活性判断骨、软骨细胞的活力的方法是敏感和特异的。本实验所用的是正常骨而不是肿瘤骨，微波加热对肿瘤骨生物力学的影响与本研究是否相同，以及微波加热对体内骨诱导性及传导性的影响、对临床骨肿瘤的作用尚需要进一步研究。
【】
1 Wong SYP, Dunstan CR, Evans RA, et al. The determination of bone viability. A histochemical method for identification of lactate dehydrogenase activity in osteocytes in fresh calcified and decalcified section of human bone. Pathology，1982, 14:439～442.
2 Liebergall M, Abu-Sneineh CH, Eylon S, et al. Effect of microwave oven induced mild hyperthermia on bone viability and strength. Clin Orthop， 2000, 372:272～279.
3 Liebergall M, Simkin A, Mendelson S, et al. Effect of moderate bone hyperthermia on cell viability and mechanical function. Clin Orthop， 1998, 349:242～248.
4 Harrington KD. The use of hemipelvic allograft on autoclaved grafts for reconstruction after wide resection of malignant tumors of the pelvis. J Bone Joint Surg， 1992, 74A:331～341.
5 Inokuchi T, Ninomiya H, Hironaka R. Studies on heat treatment for immediate reimplantation of resected bone. J Craniomaxillofac Surg, 1991, 19:31～39.
6 Parrish WM, Makley JT, Leeson MC, et al. The effect of hyperthermia on incorporation of cortical bone autografts. A histomorphometric and biochemical study. Transactions of the Orthopaedic research society, 1995, 41st Annual meeting, Orlando.
