Shirley Clift modified-TG 小鼠基因组DNA提取方法及其在Gene -Trap中的应用
【摘要】 目的：介绍一种简单、快速、高效同时从数十、甚至上百个小鼠尾巴中提取基因组DNA的方法。方法 Shirley Clift modified-TG 小鼠Gene-Trap DNA提取法。结果 使用该法从小鼠尾巴中获取的基因组DNA的数量、纯度完全适用各种实验，如在C3H/HCJ-Mgrn1md转基因小鼠杂交C57BL/6小鼠 Mahogunin基因变异传代培殖实验中，应用鼠尾抽提的DNA 进行Gene-trap。类推该法到小鼠其它组织如肝、肾、肌肉和心脏，也同样得到了高质量的基因组DNA。结论 该技术可以连续、高效、快速、批量从小鼠组织中提取基因组DNA，为国内利用小鼠进行基因遗传疾病的研究提供了基础方法。
【关键词】 小鼠 基因组DNA DNA提取 基因型鉴定
【Abstract】 Objective To introduce a very simple, fast, available method for extracting genomic DNA from several, even tens of mice tails simultaneously. Methods Using mice Gene-Trap DNA isolation procedure created by Shirley Clift modified-TG. Results The genomic DNA quantity and quality extracted from mice tails by this method completely made the experiment ends meet. In such case, the data of Gene-trap test derived from mice tails genomic DNA by this method showed a high quality genomic DNA in the gene mutation generation produced by C3H/HCJ-Mgrn1md transgenic mice mating with normal C57BL/6 mice, and so were extrapolation to other tissues such as livers, kidneys, muscles and hearts. Conclusion Such simple, fast, incessant, valid procedure for extracting high quality genomic DNA from many mice tissues simultaneously will provide practitioners with an additional tool to study the genetic disorders of mice in our country.
【Key Words】 Mice Genomic DNA DNA extraction Genotyping
从小鼠尾巴中提取DNA并对其基因型进行确定，在实验室的研究中应用得极为广泛，如基因克隆、基因的多态性分析、信号传导、基因突变、数量性状位点等，其中转基因小鼠培养和维持不同基因类型疾病杂交后代的基因型鉴定以及利用微卫星做图锁定基因染色体上的位点，成为当前的热点。建立一种简单、快速、高效并同时从数十甚至上百个小鼠尾巴中提取基因组DNA的方法是进行这方面研究的第一步。当前，国内对于提取血液基因组DNA的方法报道很多［１～４］，但从动物组织中［５～８］尤其是从小鼠组织中快速提取DNA鲜有报道。汪永庆等［５］报道从大仓鼠组织中提取基因组DNA的改进方法是从鼠组织中提取DNA的较好方法之一。但该法每个标本都要用到电动匀浆器，并不适合大批量样本提取，因为单是为避免各样本之间交叉污染，清洗电动匀浆器转头就是一项耗时费力的工作。所以，要连续数月在同一天从数十上百个小鼠尾巴中提取基因组DNA并应用到实验中，报道的方法显然不能满足大量样本的提取。作者2004-2005年度在美国康奈尔大学生物医学系Dr.Gunn实验室，使用了Shirley Clift modified-TG 小鼠Gene-Trap DNA提取方法，该法不但简单快速高效，而且在转基因小鼠培养和基因QTL作图等方面获得了较好的验证。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 剪取小鼠尾巴0.4～0.8cm，放入1.5ml Eppendorf管中，当天用于基因组DNA提取或者放入-20℃冰箱保存数天也可，如需长期贮存，则应放入-80℃冰箱。
1.2 试剂DNA提取缓冲液［0.1M NaCl, 50 mM Tris-HCl(pH8.0), 2.5mM EDTA, 0.5%SDS］；蛋白酶K（100μg/ml）,使用前加入；8M醋酸钾；氯仿；100%乙醇；75%乙醇；TE或灭菌ddH2O。
1.3 操作步骤 （1）根据样本数量配制DNA提取液：配制原则是10ml DNA提取缓冲液加2ml 100μg/ml蛋白酶K。（2）取约50mg新鲜组织放入1.5ml Eppendorf管中或冷冻在-80℃低温冰箱中的组织（心、肝、肾、脾、肌肉或尾巴）已预放好在1.5ml Eppendorf管中，加入400ul DNA提取液，紧闭盖子，放在63℃温箱旋涡混合器上振荡约2h，振荡速度250 rpm，溶解基本上是完全的，仅留有少许尾骨残骸。（3）每管中加入75μl 8M醋酸钾 （4）在通风厨中向每支管子中加入0.5 ml氯仿 （5）摇匀后放入冰箱（4℃）＞15min（6）在高速离心机中5000 rpm 离心10min （7）移取上清到另一离心管中。吸取上清应尽可能地靠近分层界面（HMW DNA 有时候刚好就接近分层界面处，少许碎骸是可以接受的）。（8）向管中加入2倍上清液体积的100%乙醇（室温，1ml）,迅速颠倒几次Eppendorf管，在高速离心机中5000 rpm 离心5min，小心弃上清，确保DNA颗粒沉淀留在管底。（9）用70%乙醇洗涤沉淀，用移液器移去70%乙醇，确保DNA颗粒仍留在管内，离心片刻，将残余乙醇移走，置空气中干燥（管子盖打开放在实验桌上）。（10）干燥后（25℃室温，大约0.5h）将其溶于适量灭菌水或TE（pH8.0）中（一般用100μl）。
1.4 DNA质量检测 DNA经稀释后在Backman Du-520紫外分光光度计上测260nm和280nm的吸光度，并DNA浓度。
1.5剪取0.5～0.8cm Mahogunin转基因试验小鼠尾巴，提取基因组DNA最终浓度大约为700ng～1100ng/μl，计算A260/A280值通常都在在1.7～1.8之间。通常情况下，把提取的DNA吸取10μl按1：10稀释直接应用于PCR扩增、Sothern blot、酶切转染和测序。
2 结果
C3H/HCJ-Mgrn1md转基因小鼠与C57BL/6小鼠杂交后传至第三代——杂合体交配后所繁殖的后代，剪取鼠尾提取基因组DNA鉴定基因型。应用Forward primer: GTGTTGGGCTTAGGTTGGA和 Reverse primer: GAAGGACCCCTCATGATTG配对获得野生型（wt）PCR扩增产物644bp;或者与另外一个Reverse primer: TCTAGGACAAGAGGGCGAG配对获得gene-trap（gt） PCR扩增产物564bp。产物应用2%琼脂糖电泳如图所示，该图为提取Mahogunin转基因试验小鼠中的17个小鼠基因型鉴定电泳图。由两窝三代杂合体转基因鼠产生的后代，共17只。可以看出：野生基因型（wt*wt）有8只，编号分别为39、41、42、45、2032、2033、2034、2036、2037、2039这些一般不再需要继续培植；杂合基因型（wt*gt）有6只，编号分别为40、43、44、2030、2031、2038，这些要根据条件来取舍。纯合体基因型（gt*gt）一只2035号，属于目的小鼠。通常情况下，该纯合体小鼠生存期非常短，有的刚生下来就夭折，有的会稍长一点，如两周内死亡。而通常一个实验室会有多个课题同时进行，数十笼基因小鼠培养所产生的后代都需要及时鉴定基因型，并且给予及时分笼培养。经过提取基因组DNA进行基因型鉴定，符合条件的保留，不需要的及时处理，以节约试验成本，这就要求须在小鼠出生半个月后立即进行。应用该法提取小鼠的其它的组织如心脏、肝脏、肾脏、肌肉等都同样获得了满意的结果，曾作过电泳图表明肝组织提取的基因组DNA产量最高。
图1 17只小鼠Gene-trap电泳图。（略）
Wt:野生型；gt:突变型。数字表示每只小鼠的编号，+/+表示野生型对照，+/-表示杂合体小鼠对照
3 讨论
本文所报道的方法由Dr.Shirley Clift首先使用在自己的实验室中，后来经Dr.Gunn修改后应用在她自己的实验室中。当前，不论是传统的还是改良的从动植物组织中提取基因组DNA方法的报道［５，６，１０］，第一步工作都需要剪碎、研磨或打碎组织。常用的工具有玻璃匀浆器［６，１１］、研钵［１０］、电动匀浆器［５］，使得起始步骤较为繁锁费时。国内外每个实验室很少有大量研磨或打碎的工具可供使用，每次少量标本还可以满足实验的需要。如果提取样本数十上百，就需要反复利用有限的研磨工具，这不仅仅需要反复清理、循环利用研磨工具，还极大地增加了工作强度延长了实验时间，更容易造成标本之间的交叉污染。Shirley Clift modified-TG 小鼠基因组DNA提取方法恰恰避开了该步骤，它利用常规实验室的温箱和旋涡混合器组合可以在两个小时之内处理数十上百个标本，尽管标本量大，但完成整个抽提时间仅需大约4h。作者曾在这样的时间段一次完成110个样本的DNA抽提。与传统的酚氯仿法［６］37℃水浴1h，随后50℃水浴3h相比，该法操作简单、快速、高效，适用于提取大量样本。国内多篇文章报导了有关酚使用存在的缺点，如酚的平衡、保存时间短等问题，且使用氧化的饱和酚，能使DNA产量降低或者造成DNA碎片问题的出现［１，５，７，９，１０］。应用该法同改良的基因组DNA方法［５］一样，避免了酚试剂的使用，却并不影响提取DNA的质量。作者曾应用该法提取的基因组DNA，在基因克隆中、在Southern blot中、在PCR扩增后的片段测序中进行实验，都取得了满意的结果（数据无显示）。该法对比汪永庆等［５］的报道方法，不但避免了应用电动匀浆器在样本之间造成交叉污染的可能，还极大减轻实际工作量。在蛋白酶K的用量上，相比汪永庆等法［５］DNA提取缓冲液蛋白酶K终浓度400μg/ml，该法DNA提取缓冲液终浓度只有17μg/ml。
简捷快速的实验步骤，体现在1.5 ml Eppendorf管中小块的动物组织不需研磨，直接加入含蛋白酶K 的DNA提取缓冲液温箱中振荡孵育，在整个过程中只需换管一次，减少了污染的机率，提高了实验的效率。提取的过程有两个环节可以灵活调整，便于技术人员合理安排时间。第一可以调整温箱孵育振荡的时间。如果需要过夜（12～15h），可以把配制的公式改为10ml DNA提取缓冲液加1ml 100μg/ml蛋白酶K，并把温箱的温度调节为58℃。二是在从温箱取出，加完醋酸钾和氯仿后，摇匀放入冰箱（4℃）＞15min，这段时间可适当延长，也能放在-20℃冰箱过夜可达数天。这两种做法所在实验室已证实对结果无影响。
大批量从小鼠组织中提取基因组DNA的方法，成为各实验室利用小鼠研究基因遗传的一个重要手段。
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