大鼠皮肤创伤愈合瘢痕的三维重建和体积定量

                  作者：李幼忱，李志，刘杰，王德文，姜志国，马俊杰，高亚兵，左红艳，康悦

【摘要】  目的 对大鼠皮肤创伤愈合形成的瘢痕进行三维重建和体积定量，探索其在创伤愈合实验研究瘢痕评价中的应用。方法 Wistar大鼠8只，麻醉下制背部直径8 mm的圆形全层皮肤缺损。术后1个月取愈合区皮肤常规固定，制备等距连续石蜡切片（切片间距为200 μm），HE染色。光镜下采集组织学照片，依据瘢痕的形态学特征圈定瘢痕图像。利用Imaging?Sur3D专用机软件对瘢痕进行三维重建和体积计算。 结果 每份标本获得含瘢痕组织的等距连续切片15～20张，经三维重建得到愈合组织中瘢痕的立体形态，似呈残存树桩样，中央较大，周边呈不规则根状伸入正常真皮。瘢痕平均体积为4.292±1.009 mm3。结论 三维重建技术重现了皮肤创伤愈合中瘢痕的真实形态，获得的体积参数可作为创伤愈合实验研究中瘢痕评价的定量指标。

【关键词】  创伤愈合； 瘢痕评价； 三维重建； 体积定量

    Abstract: Objective  The purpose of this study was to investigate the feasibility of three?dimensional (3?D) reconstruction and volume quantitative estimation of scar formed in experimental studies of skin wound healing. Methods   A full?thickness skin defect wound (8 mm in diameter) was cut in the back of Wistar rats (n=8). 1 month after operation, samples including scar were harvested, fixed and embedded. Histological serial paraffin sections (200  μm apart) were obtained and stained with HE, which were digitally imaged using a microscope and digital camera linked to a personal computer. The scar image was prepared upon its pathological character. Imaging?Sur3D software was used for 3?D reconstruction and volume estimation.  Results  Fifteen to twenty sequential sections including scar from each sample were used for 3?D reconstruction and volume estimation. The spatial arrangement of the scar looked like a stump of a tree with roots extenting into surrounding normal dermis. The average volume of a scar was about 4.292± 1.009  mm3.  Conclusion  This study demonstrates the 3?D shapes of the scar in the skin and provides quantitative volume data of scar, making a better scar assessment scale in experimental studies of skin wound healing.

    Key words: wound healing; scar assessment; three?dimensional reconstruction; volume quantitation

    成体皮肤全层损伤最终以瘢痕愈合，不但带来美容问题，严重者可引起局部功能障碍。因此，如何减少皮肤创伤愈合中的瘢痕形成和对已有瘢痕的研究是创伤愈合研究的重要组成部分，其方法和手段涉及物理（激光、放射）、化学（药物）和生物技术（生长因子、干细胞）等多项领域。如何准确地评价各种治疗方法的有效性，其中对瘢痕的定量评价至关重要［1］。

    目前使用较多、较为成熟的瘢痕评价方法是通过对瘢痕的色泽、厚度和韧性进行半定量评分或定量测量，以间接反映瘢痕量，多用于临床研究［2，3］。有关瘢痕绝对定量的方法报道较少。本研究利用通过二维平面信息获得三维立体参数的体视学原理，以创伤愈合病所见为基础，结合计算机图像处理技术，对大鼠背部皮肤创面愈合中形成的瘢痕进行三维重建和瘢痕体积计算，旨在为创伤愈合实验研究寻找一项较为客观的瘢痕定量评价指标。

    1  材料和方法[*2]

    1.1  动物实验和组织切片的制备    Wistar大鼠8只，30 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，背部去毛。沿直径8 mm的圆形边界剪切，致皮肤全层缺损，创面暴露，单笼饲养。术后一个月处死动物，切取含有完整愈合组织的全层皮肤，贴于滤纸上，置10%中性福尔马林液固定，常规石蜡包埋。制片时从第一张含有完整皮肤组织切面的切片开始收集，每隔200 μm获取一张，连续编号，至组织块完全切完为止。常规HE染色。

    1.2  图像资料的获取

    光镜下（4倍物镜）拍摄HE染色组织学照片，视野中尽可能包含完整的愈合区域，如超过一个视野，通过平移视野连续拍摄数张。在Photoshop软件中，将同一切面中的所有视野准确对接，获得完整的皮肤愈合切面。通过瘢痕组织的病理学特点，勾画出切面中的瘢痕范围，剪切并另存获得一张完整的瘢痕图像。

    1.3  三维重建和体积计算

    获得的等距连续瘢痕图像经北航图像分析中心自主研发的Imaging?Sur3D三维重建软件处理，获得瘢痕的三维立体形态。根据体视学原理，将一个不规则物体平行切割，当分割间距达到足够小，每一单元可近似为柱体，单元体积为截面积乘以分割间距，则该不规则物体的体积为各单元体积之和，即所有截面面积之和乘以截面间距。根据此原理编写相应程序，利用上述获得的图像资料，计算出每一份皮肤愈合组织中的瘢痕体积量。

    2  结果

    每份皮肤样本均获得含愈合瘢痕组织的等距连续切片15～20张。低倍下可见，皮肤缺损区已被较致密的结缔组织充填，表皮完全修复，相邻两端为富含毛囊结构的正常真皮组织（图1）。高倍下见愈合组织内无毛囊和皮脂腺等皮肤附属器结构，胶原纤维束纤细，平行于表皮面呈波浪样排列，毛细血管较少，成纤维细胞向梭形的纤维细胞转归，细胞平行于胶原纤维散在分布，为典型的皮肤瘢痕病理所见（图2）。而正常真皮组织内，胶原纤维束粗大、疏松、卷曲，细胞较少（图3）。在HE染色切片中依据上述形态学特征，较易分辨瘢痕组织和正常真皮组织（图4）。 位于连续切片中央的切面中，瘢痕相对面积较大，近似上窄下宽的梯形（图5）；随着向连续切片的两端，组织中央部的瘢痕面积逐渐缩小，上、下两条边更为细长，似不规则的“工”字形（图6）。通过三维重建软件的处理，得到愈合瘢痕的立体形态，似残存树桩样结构，中央较粗大，周边呈不规则根状伸入正常真皮（图7，8）。

    本组实验中，3例标本的等距连续切片的第一张即含有瘢痕组织，说明取材不完整，未包含全部的瘢痕组织，不能用于体积计算。另5例的连续切片中首尾两端均包含至少一张完全的正常皮肤组织切片，处理后的瘢痕图像可用于体积计算，经图像分析并计算获得体积，分别为3.034、5.583、3.544、4.603和4.697 mm3，平均为4.292±1.009 mm3。

    3   讨论[*2]

   3.1  瘢痕评价中存在的问题    在创伤愈合和瘢痕研究中，建立有效的瘢痕评价体系是确定一项干预措施是否对瘢痕形成产生影响的重要前提。目前瘢痕评价的研究主要集中在临床研究领域，包括主观评价和客观评价两个方面。主观评价是对肉眼观察到的瘢痕色泽、厚度和韧性等进行描述或对观察结果进行半定量评分，如常用的Vancouver瘢痕分级法［4］。由于是建立在定性和半定量观察的基础上，其稳定性和有效性存在缺陷［5］。随着检测技术的，相继出现一些定量的客观评价方法，如通过分光光度仪测量皮肤颜色，利用超声波测定瘢痕厚度等，然而这些仍然是间接地反映瘢痕量，更适合于非创伤性临床研究［6-8］。

    在创伤愈合实验研究中，对瘢痕评价的系统性研究较少。不同于临床研究，动物实验中组织标本可完全获取，因此多采用光镜下直接进行病观察。皮肤瘢痕是皮肤创伤病理性修复结果，胶原在真皮中沉积，后期每呈玻璃样变。因此，对组织切片的病理学观察是客观描述瘢痕的最直接也是最准确的手段。为进行定量评价，以往多根据病理学所见进行评分，近年有报道通过机图像分析技术计算切面中的相对瘢痕面积作为瘢痕评价指标。然而切片提供的只能是二维平面信息，忽略了不同截面的差异，其前提应是建立在瘢痕均匀分布的基础上。那么，瘢痕在真皮组织中的空间结构究竟如何？能否直接获得瘢痕的体积数量作为定量评价指标？已成为亟待解决的课题。

    3.2  三维重建技术在医学研究中的应用

    20世纪80年代以来，医学影像学和计算机软件技术的共同发展，使利用一系列二维图像信息进行不规则体的三维重建成为可能，如利用磁共振或断层扫描术重建机体内的三维解剖结构，利用超声血管造影术重建冠状动脉，利用电镜或共聚焦扫描显微技术重建细胞核或粒子等微观结构等。随着计算机三维重建技术的日趋成熟和完善，图像信息的来源也可抛开对大型仪器设备的依赖，利用传统的组织学切片进行三维重建，如肾单位的重建、肿瘤在组织中的占位重现等。总之，三维重建技术已渐广泛应用于医学研究的各个领域，使研究兴趣区变得更为直观［9-12］。

    然而，迄今三维重建技术在创伤愈合瘢痕研究领域的应用尚少。本研究利用愈合皮肤组织标本的系列等距连续切片，重现瘢痕在愈合组织中的空间结构，并获得瘢痕体积值作为瘢痕评价的定量指标。结果显示，瘢痕在真皮组织中呈不规则分布，愈合组织的中央和边缘，其截面中瘢痕所占的相对面积差异较大，因此，在瘢痕评价中若仅使用单个切片信息，将存在不可避免的片面性。

    3.3  瘢痕三维重建和体积计算中的注意事项

    从理论上，在三维重建和体积计算中使用的平行切面越多，重建和计算结果越接近真实。然而无限扩大切片数量，将极大地增加工作量。切片间距取决于待测标本中兴趣区的大小和连续性，尤其对于存在较小的不连续兴趣区，标本间距过大会导致兴趣区的丢失。因此，选择最优化的切片间距非常重要。瘢痕在愈合局部真皮中为连续变化，本实验采用200 μm间距，每组三维重建和计算使用的有效图像数量为15～20 张。重建后的三维图像虽不够光滑细腻，但足以体现出瘢痕组织在真皮中延伸的不规则形态。

    原始图像的完整性也是影响三维重建和体积计算结果的重要因素。大鼠背部创面愈合早期，可通过表观较易分辨愈合组织所处位置，但随着愈合时间的延长，局部表皮修复，周边毛发生长覆盖。为准确获取愈合组织，应在皮肤去毛后仔细观察，瘢痕区皮肤色泽苍白、表面无毛发生长，在组织取材和蜡块包埋时，应尽可能多地带有周边正常皮肤组织。在连续切片首尾两端应至少出现一张不包含瘢痕组织的正常皮肤组织切片，说明实验取材完全覆盖了标本中瘢痕的全部信息，该组切片才能用于三维重建和体积计算。

    另外，创伤初始面积的差异、动物皮肤厚度和愈合能力的个体差异等，都会对瘢痕体积产生影响。因此，可采取以下措施尽可能地减少实验中的系统误差：留取初始创面记录，对最终结果进行校正；实验设计中设立同体对照，采用配对分组的统计学分析；在前期瘢痕图像处理过程中，对瘢痕区域的勾画应由同一实验者在双盲原则下完成。

    综上所述，以瘢痕的病理学所见为基础，通过计算机图像分析技术，重现皮肤创伤愈合中瘢痕的真实形态和获得其体积值作为瘢痕的定量评价指标是完全可行的，诚然，在实际应用中还有待进一步摸索和完善。

【】
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