活体动物体内成像技术及其在生物医学中的应用进展
作者：周涛, 韩彧 巩伟丽, 赵春林
【摘要】 活体动物体内成像是近年来新兴的检测活体动物体内基因表达及细胞活动的光学成像技术,具有操作简便，直观性强的特点。这项技术包括生物发光成像和荧光成像，采用报告基因产生的生物发光、荧光蛋白质或染料产生的荧光作为体内生物光源，与新型冷CCD成像相结合，实时探测活体动物体内生理或病理条件下的细胞和分子事件。本文简要综述了活体动物体内成像技术的原理、应用领域及前景。
【关键词】 体内光学成像; 生物发光; 荧光
Abstract: In vivo optical imaging, including bioluminescence and fluorescence imaging, is one of the newly developed tools that enable analyses of cellular and molecular events in intact living animals noninvasively. This technology employs internal biological sources of light emitted from luciferases, fluorescent proteins or dyes, to label genes and cells. Combining these reporters with the new generation of charge coupled device (CCD) cameras, cellular and molecular features of physiology and disease in real time. This paper provides a review of principle, development and application of this imaging strategy.
Key words: In vivo optical imaging; bioluminescence; fluorescence
活体动物体内光学成像(optical in vivo imaging)主要采用生物发光（bio?luminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。生物发光是用荧光素酶(luciferase)基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP）,或 Cyt及dyes等荧光染料进行标记，利用报告基因产生的生物发光、荧光蛋白质或染料产生的荧光就可以形成体内的生物光源。两者的主要区别在于前者是动物体内的自发荧光，不需要激发光源。而后者则需要外界激发光源的激发。虽然哺乳动物组织是不透光的，但是利用灵敏的光子成像技术可以从动物体表检测到组织内部的生物光源，使研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为，这是一种十分有效的研究实验动物生理过程的技术。因操作简单、结果直观、灵敏度高等特点，这项技术广泛应用于生命、医学研究及药物开发等方面，用以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。
1 成像原理
哺乳动物生物发光，是将Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象（见图1）。这种酶在ATP及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。对于细菌，lux操纵子由编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成，带有这种操纵子的细菌会持续发光，不需要外源性底物（见图2）。
图1 生物发光原理。将荧光素酶基因连接于启动子下游，稳定整合到细胞染色体内，使荧光素酶得到持续表达。在体内，荧光素酶在ATP、氧气存在的条件下，与外源注入的特异底物反应产生发光现象。
图2 lux操纵子由编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成，带有这种操纵子的细菌会持续发光，不需要外源性底物。
基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。标记细胞的方法基本上是通过分子克隆技术, 将荧光素酶的基因插到细胞染色体内，通过单克隆细胞筛选, 培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。将标记好的细胞注入小鼠体内后, 观测前需要注射荧光素酶的底物—荧光素。荧光素为约280道尔顿的小分子，脂溶性非常好, 可以透过血脑屏障。注射一次荧光素能保持小鼠体内荧光素酶标记的细胞发光30～45分钟。每次荧光素酶催化反应只产生一个光子，这是肉眼无法观察到的，需要使用特殊的仪器观测并记录。如美国精诺真公司(Xenogen Corp.)生产的IVIS 成像系统，应用一个超低温下高度灵敏的CCD相机及特别设计的成像暗箱和成像软件，可精确观测并记录到这些光子。
哺乳动物的荧光发光则有多种方式，既可以将GFP或其突变体基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光蛋白，在激发光源的作用下而发光，也可以利用一些荧光基团标记特定的物质，注入小动物体内而发光。
激发荧光的光源目前主要采用的是卤钨灯，其波长覆盖范围为360～2000 nm，卤钨灯的输出非常稳定，输出谱线非常平滑，无断裂、尖峰或凹陷。相对而言,采用氙灯作为激发光源其覆盖范围窄，且具有一些很高的尖峰和凹陷，易造成输出的不稳定。理想的激发光光源，除具有以上特点外，还应具有较高的功率，使得激发光的能量高，从而更利于荧光信号的检测。
与生物发光相比，在荧光外界激发光源作用下，小动物的皮毛往往容易激发出背景噪音，这些背景噪音信号与目标信号相互混淆。理想的成像结果往往需要采用特定的去背景噪音技术对背景噪音信号与目标信号进行区分。不同公司的产品在这方面各有特点，以美国精诺真公司为例，其所采用的去背景噪音技术是建立在NIST国际标准定量的基础上，采用特定波段的背景滤镜，经过相应的算法，可特异性地将每次成像动物组织所引起的背景噪音去除，从而极大地提高荧光的信噪比。
2 实验步骤[*2]2.1 标记细胞 通过分子克隆技术，筛选单克隆细胞，将荧光素酶的基因或荧光蛋白的基因稳定整合到细胞染色体内，培养出能稳定表达荧光素酶或荧光蛋白的细胞株。
2.2 仪器操作 （以Xenogen IVIS 系统为例）
典型的成像过程是：小鼠经过麻醉系统麻醉后放入成像暗箱平台，软件控制平台的升降到一个合适的视野，自动开启照明灯拍摄第一次背景图。下一步，生物发光成像时，自动关闭照明灯, 在没有外界光源的条件下拍摄由小鼠体内发出的光。 与第一次的背景图叠加后可以清楚的显示动物体内光源的位置，从而完成成像操作。对于荧光成像，则需要选择合适的激发和发射滤片，开启激发光源，激发荧光物质而发光。之后，软件完成图像分析过程。使用者可以方便的选取感兴趣的区域进行测量和数据处理及保存工作。当选定需要测量的区域后，软件可以出此区域发出的光子数，获得实验数据。软件的数据处理和保存功能非常强大，可以加快实验速度，方便大批量的实验。
3 技术特性
比较目前的活体生物体内成像技术，如超声（Ultrasound）、计算机断层摄影（Computed Tomography，CT）、核磁共振（Magnetic Resonance Imaging，MRI）、正衍射成像（Positron?Emission Tomography，PET）、单光子衍射(Single?Photon?Emission Computed Tomography, SPECT)等技术，体内可见光成像技术具有许多独特的优点，如操作简便，测量快速（短于5分钟），同时可检测多个动物，费用低廉等。
作为体内报告源，生物发光较之荧光的优点之一为不需要激发光的激发, 它是以酶和底物的特异作用而发光。由于动物体自身不会发光，这样生物发光就具有极低的背景。虽然生物发光的信号低于荧光信号，但其极低的自发光水平使得信噪比远高于荧光信号。另外, 生物发光信号可以方便计量，即便标记细胞在动物体内有复杂的定位，亦可从动物体表的信号水平直接得出发光细胞的数量。而对于荧光，信号水平取决于发光细胞的数量及激发光的强度，且光线穿过的组织对其有强烈的吸收，这使得荧光强度很难计量。由于荧光素酶在表达后快速合成并具有较短的寿命，而成为环境条件快速变化（如感染疾病）的反应探针。
荧光发光需要激发光才能使荧光基团达到较高的能量水平，然后发射出较长波长的发射光。荧光成像的波长范围通常在400～900 nm之间，包括一些常见的荧光染料及荧光蛋白，如GFP、DsRed、CY5.5以及最近用得较多的VivoFluo染料系列及Qdot系列, 这些染料有不同的波长范围可供选择［1］。同时为了方便荧光的标记，一些具有科研实力的公司如精诺真公司还研制出荧光标记的试剂盒，用于蛋白、肽段等的标记。由于在活体内相对波长越长的光越容易穿透组织，因此在选择荧光染料或荧光蛋白时应选择散射光波长介于600 nm～900 nm的近红外荧光。生物体内很多物质（如毛发、胶原、软骨等）在受到激发光激发后，会产生较强的自发荧光，这些非特异性荧光会严重影响检测灵敏度。特别是当发光细胞深藏于组织内部，需要较高能量的激发光源时，产生的背景噪音会很高，因此需要尽可能去除这部分信号。但荧光发光检测操作简单，无需注入底物，且发光强度高。可根据两者所具有的特点以及实验要求如组织的光学条件（报告源的深度、体积及组织吸光度等），选择适合的发光探针。
4 技术应用
随着科学技术的发展，分子成像技术已经与包括遗传工程模式动物在内的动物研究策略有效地结合在一起。这项技术可以实现无损伤的在动物体内评价代表效果的分子和细胞事件，因此可以利用同一组动物进行长时间的研究，从而大大减少了实验动物的使用数量。更为有力的是，由于一系列的数据来源于同一只或同一组动物，以自身作为内对照，大大增加了数据的可靠性。
通过活体动物体内成像系统，可观测到疾病或癌症的发展进程以及药物治疗所产生的反应，并可用于病毒学研究、构建转基因动物模型、siRNA研究、干细胞研究、蛋白质相互作用研究以及细胞体外检测等领域。
4.1 癌症与抗癌药物研究［2］
直接快速地观察各种癌症模型中肿瘤的生长和转移，并可对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估。活体生物发光成像能够无创伤地定量检测小鼠整体的原位瘤、转移瘤及自发瘤。精诺真生物成像技术提高了检测的灵敏度，即使微小的转移灶也能被检测到（可以检测到体内102个细胞的微转移）。目前已商品化的肿瘤细胞株包括：前列腺癌,黑色素瘤，乳腺癌，肺癌，子宫颈癌和结肠癌等 BiowareTM细胞系模型。Rehemtulla［3］ 等人采用携带前体药物转化酶和酵母胞嘧啶脱氨酶基因的腺病毒载体，运用活体成像技术与磁共振成像技术(magnetic resonance imaging，MRI)研究了其作为转基因治疗药物在癌症治疗中的效果。
4.2 免疫学与干细胞研究
将荧光素酶标记的造血干细胞移植入脾及骨髓，可用于实时观测动物活体体内干细胞造血过程的早期事件及动力学变化［4］。有研究表明，应用带有生物发光标记基因的小鼠淋巴细胞，检测放射及化学药物治疗的效果，寻找在肿瘤骨髓转移及抗肿瘤免疫治疗中复杂的细胞机制。应用可见光活体成像原理标记细胞，建立动物模型，可有效地针对同一组动物进行连续的观察，节约动物样品数，同时能更快捷地得到免疫系统中病原体的转移途径及抗性蛋白表达的改变。
近年来，不少报道介绍了应用活体成像技术研究免疫细胞迁移的实例。其中之一是利用人多发性硬化症的小鼠模型观察实验性自免疫脑脊髓炎中自身抗原反应性CD4+ T细胞的迁移模式［5］。包含荧光素酶和GFP基因的逆转录病毒载体处理特定的CD4+ T 细胞。首先用流式细胞仪分选GFP发光的细胞，然后分别注入对照及实验组动物体内［5］。荧光素酶在活体的发光情况表明标记的CD4+ T细胞迁移至中枢神经系统，而GFP可以进一步用于这些细胞的组织学定位。双功能报告基因的应用极大地方便了特定免疫细胞的筛选及迁移研究。
4.3 细胞凋亡
在正常生理条件下，细胞增殖和凋亡是严格协调的，这种平衡一旦打破，就会导致一系列的疾病，包括AIDS、神经退行性疾病、脊髓炎综合症、缺血/再灌注损伤及肿瘤等等。当荧光素酶与抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳动物细胞中表达，产生的融合蛋白无荧光素酶活性，细胞不能发光，而当细胞发生凋亡时，活化的caspase?3在特异识别位点切割去掉抑制蛋白，恢复荧光素酶活性，产生发光现象，由此可用于观察活体动物体内的细胞凋亡相关事件［6］。
4.4 标记病毒
4.4.1 病毒侵染
以荧光素酶基因标记的HSV?1病毒为例［7］，可观察到HSV?1病毒对肝脏、肺、脾及淋巴结的侵和病毒从血液系统进入神经系统的过程。多种病毒已被荧光素酶标记，用于观察病毒对机体的侵染过程。
4.4.2 基因
基因治疗包括在体内将一个或多个感兴趣的基因及其产物安全而有效地传递到靶细胞。目前，基因治疗主要是以病毒做载体, 可应用荧光素酶基因作为报告基因用于载体的构建，观察目的基因是否能够在实验动物体内持续高效和组织特异性表达。这种非侵入方式具有容易准备、低毒性及免疫反应轻微等优点。荧光素酶基因也可以插入脂质体包裹的DNA分子中, 用来观察脂质体为载体的DNA运输和基因治疗情况［7］。
4.5 标记细菌
利用细菌荧光素酶基因可以分别标记革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。常用的几十种细菌都已被标记, 用来进行细菌侵染和抗生素药物的研究。
细菌侵染研究: 可以用标记好的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌侵染活体动物, 观测其在动物体内的繁殖部位、数量变化及对外界因素的反应。
抗生素药物研究: 利用标记好的细菌在动物体内对药物的反应，医药公司和研究机构可用这种成像技术进行药物筛选和临床前动物实验研究。近年来，国际上大型制药公司纷纷将精诺真技术在动物体内的实验结果作为FDA (美国食品和药品检验局)药物申报材料中非常重要的临床前动物实验部分。
4.6 基因表达和蛋白质相互作用[*2]4.6.1 组织特异性基因表达 荧光素酶是一类生物发光酶， 其中的Renilla荧光素酶和Firefly荧光素酶分别识别不同的底物。一种细胞可被这两种荧光素酶标记: Renilla 荧光素酶基因由一组成性稳定表达的启动子驱动, 作为内参，反应细胞数量的变化; Firefly荧光素酶基因由需要研究的组织特异性启动子驱动。这样Firefly荧光素酶发光信号的变化，在消除细胞数量变化的影响后就可反应特定的启动子在动物体内的表达活性。
4.6.2 蛋白质相互作用
观察细胞中或活体动物体内两种蛋白质的相互作用，是将荧光素酶基因分成两段，分别连接所研究的两种蛋白之一的编码DNA，然后导入细胞或动物体内表达为融合蛋白。当两种蛋白有强相互作用时，表达的荧光素酶两部分相互靠近形成有活性的荧光素酶，在有底物存在时出现生物发光，反映出所研究的两种蛋白存在相互作用［8］。应用此原理亦可用于研究细胞信号传导途径。
4.6.3 阻断RNA
通过对比生物发光的变化，验证在成年小鼠体内，注射双链siRNA可以特异地阻遏基因表达［9］。
4.7 转基因动物模型
为研究目的基因是在何时、何种刺激下表达，将荧光素酶基因插入目的基因启动子的下游，并稳定整合于实验动物染色体中，建立转基因动物模型［10］。利用其表达产生的荧光素酶与底物作用产生生物发光，反应目的基因的表达情况，从而实现对目的基因的研究。发育生物学方面可用于研究动物发育过程中特定基因的时空表达情况，药研究方面可观察药物诱导特定基因表达，以及其它生物学事件引起的相应基因表达或关闭。如图3所示。
研究者根据研究目的，将靶基因、靶细胞、病毒及细菌进行荧光素酶标记，同时转入动物体内形成所需的疾病模型，包括肿瘤、免疫系统疾病、感染疾病等等［11］。可提供靶基因在体内的实时表达和对候选药物的准确反应，还可用来评估候选药物和其它化合物的毒性，为药物在疾病中的作用机制及效用提供研究方法。
图3 利用转基因动物模型对基因表达进行研究。 以IL?2的启动子驱动荧光素酶表达，使荧光素酶与内源的IL?2平行表达。这样, 在此转基因动物模型中建成一个可以观察到IL?2表达的可见光信号。
4.8 药效评价
对于一些需化学方法进行标记的物质，如化学合成药物、纳米药物及一些肽段等，只能通过化学合成的方法与荧光染料进行偶连，检测荧光的发光情况，从而实现活体示踪的目的。目前应用较多的是对于一些肿瘤靶向药物在活体内靶点的识别、研究蛋白质－蛋白质相互作用以及跟踪化学药物在体内的分布及代谢情况等。例如用CY5.5及CY7标记RGD肽段，研究其在尾静脉注射不同时间里对移植胶质瘤中细胞粘附分子Integrinαvβ3的特异性识别过程［12,13］。在肿瘤药物相关研究中，用CY5.5标记两种脱氧核糖类似物CY5.5?2DG及CY5.5?NHS均可在小鼠活体水平上直接观测到其对肿瘤的特异性识别作用［14］。
图4 采用精诺真（Xenogen）成像亲脂DiR染料(750 nm,782 nm)标记人造血细胞G2L，移植小鼠体内24 h后观测其分布情况。深层脏器如肝脏、脾脏、肺脏以及骨骼等均能够很清晰的成像。
5 前景
活体生物发光成像技术是检测实验动物体内分子及细胞事件的强有力手段，正在被越来越广泛地应用于医学及生物学研究领域。具有极高的检测灵敏度及低廉的实验费用，可以在极短的时间内应用尽可能少的动物数量却可精确获得预期的实验结果，为研究者提供了广阔的应用空间。活体成像技术使得分子生物学家许多用于细胞或组织裂解液的方法可以实现活体内的观测，而报告基因的应用更加增强了在体无损伤研究完整细胞或活体器官功能的能力。将这种高灵敏度、高精确性的观察方法与结构成像（如CT）相结合，是该项技术的一个发展方向，将会在观测到结构信息的同时，获得功能性信息。另外，还可以利用机控制的扫描激光将不同光线投射到动物体表，这些光线投射后发生偏转，从而度量动物体表各处的高度。由数码相机成像，用活体成像软件汇总影像信息，从而得出动物体表的拓扑信息。这些信息可用于对动物体表三维拓扑图像的重组。随着小鼠及人类基因组图谱的绘制完成，可以应用生物发光为信号，在转基因鼠体内研究特定基因的表达情况，从而了解其功能。因此，生物发光成像技术推进了人们对各种生命活动、疾病过程等深入认识。随着研究的进展，可见光体内成像技术将不仅用于基础研究领域，也将会作为新技术用于临床实践，扩展到临床检验及药物治疗等领域，服务于人类的医疗卫生事业。
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