体外培养小鼠肾脏的形态计量学研究

【摘要】  目的 观察胚龄12、14、16、以及生后1天的肾组织体外培养的发育情况，与同期在体发育进行比较，探讨肾组织体外培养的胚龄选择。方法 应用光镜连续切片技术结合体视学方法定量检测培养前、后肾组织以及各期肾小体的体积。结果 胚龄12天（E12）体外培养发育情况与在体无显著差异，其余各组随胚(日)龄的增加,小鼠肾组织的体外发育呈下降趋势。结论 小鼠肾组织体外培养，胚(日)龄越小其生长发育越接近在体情况，以孕12天之前较适宜。

【关键词】  组织培养； 小鼠； 肾脏发育； 形态计量学研究

    Abstract: Objective  To observe the development of mouse kidney in vitro at embryonic day 12、14、16 and postnatal day 1, and compare with the development of homeochronous  kidney in vivo. And to select eligible the embryonic age for kidney culture in vitro. Method  Light microscope combined with stereological methods were used to observe and analyze renal tissue and corpuscles at different developmental stages in vivo and vitro. Result  There is no difference in the development kidney between in vitro and in vivo at embryonic 12 days. The developing speed of the rest renal tissue tend to decrease with age. Conclusion  In organ culture of the metanephridium the younger the age of mouse,the closer the development and growth compared with those in vivo, it is eligible before the embryonic day 12.

    Key words: organ culture； mouse；  kidney development； Morphometric Analysis

    肾组织体外培养是借助体外培养技术，将肾脏切成薄片进行培养、研究的技术 ［1］。国外学者对肾组织体外培养进行了大量研究［2］,但有关不同胚(日)龄小鼠肾组织体外培养的发育情况,及其与在体发育同步性比较的系统研究尚未见报道。国内学者对肾组织体外培养研究则更少。本文应用光镜连续切片技术结合体视学定量分析方法，对体外培养不同胚（日）龄小鼠肾组织的发育情况进行系统观察分析,确定肾组织体外培养的适宜胚龄,为在胚胎肾脏发育中各种影响因素的研究提供基本实验依据。

    1  材料与方法

　　1.1  材料    25～30  g的成年健康雌、雄性昆明系小白鼠30只，由辽宁医学院实验动物中心提供；含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，谷氨酰胺，由北京华美公司提供。

    1.2  动物培养

    昆明系小白鼠雌、雄(1∶1)同窝饲养。早8:00晚5:00观察阴道栓，见阴道栓出现计为胚龄(embryonic days，E)0  d［3］，记录受孕时间，孕鼠分笼饲养2周后,早8:00晚5:00观察生产情况，以观察到仔鼠出生的最早时间记为生后0  d。选取胚龄12、14、16、18天的胎鼠和生后1、3、5、7天的仔鼠各10只（分别来自5只孕鼠或母鼠）进行体内对照研究；胚龄12、14、16天的胎鼠及生后1天的仔鼠各20只（分别来自5只孕鼠或母鼠）进行体外培养研究。

     1.3  实验方法〖*2〗1.3.1  标本制备    各组孕鼠经10%水合氯醛麻醉（仔鼠无需麻醉）后，迅速放入75%酒精消毒，无菌条件下快速取出胎鼠或仔鼠肾脏。部分入4%多聚甲醛固定，常规脱水透明，石蜡定向包埋，用于体内对照。其余用于体外培养，孕12天胎鼠全肾培养，其余用排刀切成250～350  μm厚的薄片，在室温下仔细分离成单片，6孔培养板内每孔放入1  ml DMEM/F12培养基，并放置微孔滤膜（孔径0.4  μm），用吸管将完好的后肾组织片转移至滤膜上，每个滤膜上放5片，移去滤膜表面多余的培养液，入CO2孵箱(37℃，5％CO2)培养，每2日换液1次［4］。分别取培养2、4、6天后的肾组织入4%多聚甲醛固定，常规脱水透明，石蜡定向包埋。体内、体外肾组织包埋后，全部做5  μm厚的连续切片，等间隔选取肾组织切片，HE染色，光镜下观察并测量。

    1.3.2  体视学测量

    光镜下应用目镜方格测试系统、点计数法［5］，根据公式vv=px/pc分别测算出逗号小体、S小体、Ⅲ、Ⅳ期肾小体的体积密度,px为方格系统落在所测结构的点数，pc为方格系统落在参照系的点数（以整个肾组织为参照系）；按公式v=vv·vg出所测结构的体积，vg为肾脏或培养后的肾组织块体积（培养后肾脏总体积等于培养后各组织块的体积和）。在体发育各胚（日）龄肾脏体积和培养后各肾组织块的体积按cavalieri?s 点计数法测得，公式为v肾组织块=?p肾组织块·a2·h·?p肾组织块为100倍光镜下方格系统落在同一个肾组织块所有切片上的点数和，a方格系统中每一小格的边长，在100倍光镜下相当于实际长度0.1  mm，h为相邻切片间的距离。

    1.3.3  统计学处理

    所有实验数据用±S表示，各组间采用SPSS软件进行方差分析，P<0.05认为有统计学意义。

    2  结果

　　2.1  组织学观察     光镜下可见肾组织体外培养经历了和在体类似的发育过程，肾组织块体积增大,输尿管芽逐级分枝,在输尿管芽与生后肾组织间充质细胞的相互诱导下，其周围出现早期肾小体(即生肾区)。肾小体发育经历了逗号小体(Ⅰ期肾小体)、S小体(Ⅱ期肾小体)、Ⅲ期和Ⅳ期肾小体期(较成熟肾小体)四个阶段。以E12天体外培养为例见（图1），逗号小体的裂隙下方为肾小体原基，可见两层细胞，将分别发育成肾小囊的脏层上皮和壁层上皮。随后逗号小体出现第二裂隙，进入S小体期。Ⅲ期肾小体成卵圆形，可见肾小囊腔，不同的是体外培养的肾小体没有毛细血管袢的形成，仅是一些细胞的紧密堆积。Ⅳ期肾小体肾小囊腔进一步增宽，形成了没有毛细血管的肾小球，小球内细胞沿肾小囊排列，小球中央呈空心结构。此外，随着培养天数的增加，第一代髓旁肾小体出现，小管和髓质开始发育，与在体发育基本类同。图1  体外培养孕12天肾小体发育四个阶段（光镜  HE染色  ×400）

    2.2  体视学参数 

    Cavalieri?s 法测得不同胚(日)龄小鼠肾脏体积和培养不同天数的肾组织体积比较可知，E12天开始培养的肾组织在体外培养2、4、6天后，其体积略小于同期在体发育肾体积。而E14?6（孕14天培养6天）、E16?4（孕16天培养4天）、E16?6（孕16天培养6天）以及从N1开始培养的肾组织与同期在体发育肾体积比较差异明显（图2）。逗号小体和S小体体积的体外培养、在体发育比较可见，体外培养，胚（日）龄越大，其折线图越偏离在体的发育趋势，发育都经过一个体积高峰，在体时其高峰出现在N3天，然后下降至N7天消失。N1天体外培养逗号小体、S小体的发育高峰延迟到N5天，且高峰值低于在体值（表1和图3、图4）。较成熟肾小体体外培养胚（日）龄越大，其折线图越偏离在体的发育趋势。不论体外培养还是在体发育，都没有发育高峰，而是呈上升趋势（表1和图5）。 表1  不同胚（日）龄逗号小体、S小体和肾小体的体积注：a. 表示该组体外培养逗号小体体积与同期在体发育的比较p＜0.05,有显著差异。

    3  讨论

    本实验通过对胚龄12、14、16天和生后1天小鼠肾组织体外培养2、4、6天后的发育情况进行观察,结合体视学方法定量分析肾组织块、以及各期肾小体的体积变化，显示体外培养肾小体的发育与在体小鼠肾小体发育基本类同［6］。不同的是，体外培养肾小体发育成熟后大多形成没有血管球的肾小体，尤其是早期取材培养的肾组织，在离体时没有肾小体形成，体外培养后全部形成没有毛细血管的肾小体。这种特殊肾小体的形成与Ariel Gomez等人报道的是一致的［7，8］。有学者在胚胎后肾异体移植中发现，形成有毛细血管的肾小体，这支持内源性后肾组织来源学说［9］。本文的研究显示体外培养和异体移植是有差别的，推测这种差别的形成主要是由于一般的体外培养基不支持内皮细胞分化，而有足细胞的发生发育，有肾小体基底膜类似物的积聚，但在这些类似物的积聚区域没有层粘连蛋白亚型的转换。如把体外培养后的肾组织移植到野生型小鼠体内，校正了层粘连蛋白亚型的转化，可诱导形成肾脏脉管系统［8］。相关的其他原因还有待于进一步研究。

    此外，在我们的研究中，在体发育的肾脏体积与前人研究结果略有差异，这可能与测量方法不同有关。本实验采用Cavalieri?s点计数法测量培养前和培养后的所有肾组织体积，不仅使结果准确减少误差而且增加了其可比性。本结果表明培养的肾组织胚（日）龄不同，其发育情况也不一样。随着胚（日）龄增加，其发育情况呈下降趋势。孕12天全肾培养时，其体积虽比在体发育略小，但无统计学差异（P＞0.05），认为其与在体发育完全一致。同时分析了逗号小体、S小体、较成熟肾小体的体积变化趋势与体内发育基本吻合（P＞0.05）［10，11］，认为孕12天或更小的胚胎肾组织较适宜体外培养选择，进一步可用以研究某种外源性因子的持续作用，从而分析其对肾脏发育的影响。而这种差异的形成可能与体外培养时，培养的组织日龄越小，其细胞可塑性越好，分化能力越强，越容易存活、适应体外环境有关。孕14天肾组织培养中，培养6天后其体积发育与在体比较有显著性差别（P＜0.05）。推测除了与培养组织胚龄有关外，还与体外培养中，随培养天数增加，组织发育且体积逐渐增大，营养摄取相对减少有关。此外，在逗号小体、S小体体积发育折线图中，N1天培养的肾组织不仅发育高峰延迟，而且高峰值降低，均由于N1天体外培养肾脏发育缓慢所致。目前国内肾脏的研究多采用单细胞培养，组织器官型培养尚少见，本文通过对肾组织体外培养发育情况的观察分析，探讨了肾组织体外培养的胚龄选择，为肾组织体外培养及在胚胎肾脏发育中各种因素影响的研究提供了基本实验依据。

【】
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