大鼠尾加压素II收缩大鼠肺动脉干与蛋白激酶C通路相关性研究

               作者：薛必成 陈少贤 龚永生 徐正 王良兴 范小芳 

【摘要】  目的 研究大鼠尾加压素-II（RUII）收缩大鼠离体肺动脉干环与细胞信号转导通路蛋白激酶C通道的关系。方法 从雄性Sprague-Dauley大鼠中分离出肺动脉干，切成3～4mm的血管环，用RUII（10nmol/L）预收缩血管达坪台期后，加入蛋白激酶C通道阻断剂H-7，制备H-7(0.1～100μmol/L) 浓度—效应舒张曲线，最后分别EC50和Emax。 结果 H-7呈浓度依赖性舒张大鼠RUII预收缩的肺动脉干 -log［EC50］=5.26±0.36, Emax =(97.21±17.86)%。 结论 细胞信号转导通路蛋白激酶C通道的激活参与大鼠尾加压素-II收缩大鼠肺动脉干效应。

【关键词】  尾加压素-II 蛋白激酶C 肺动脉干

　　【Abtract】  Objective  The aim of our study was to investigate the influence of protein kianse C inhibition on rat urotensin II induced vasoconstriction. Methods  The main truncus pulmonalis was dissected from the male Sprague-Dawley rat， artery ring width was 3～4mm.Inhibitor of protein kinase C channel,H-7(0.1～100μmol/L) were added into medium after rat urotensin II（10nmol/L）induced vasoconstriction had reached plateau to construct the relaxant concentration-response curves and their EC50 and Emax. Results  H-7 caused concentration-dependent relaxations of rat urotensin II precontracted arteries  ［-log［EC50］=5.26±0.36, Emax =(97.21±17.86)% of the response to 10 nmol/L rat urotensin II］. Conclusion  Rat UII induced rat main pulmonary artery contraction is related to the activation of protein kinase C signal transduciton pathway.

　　【Key words】  urotensin II  protein kinase C  truncus pulmonalis   

　　尾加压素-II(RU II)是最早从硬骨鱼尾部神经内分泌系统中提取出来的多肽［１］，随后，两栖类及哺乳类动物大脑中也发现RUII，起生物学效应的羧基末端是环形六肽结构，它在从鱼到人的物种中呈高度的保守性［２］。RUII受体为G蛋白藕联受体GPR-14［３］，它是迄今为止所发现的最强效血管收缩活性肽［４］。RUII收缩血管效应与多条细胞信号转导通路有关，例如已有的研究结果，表明RUII收缩血管作用与激活Ca离子通道、Rho激酶、蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）、酪氨酸激酶及磷酯酶C通路等有关［5］。另外，研究表明RUII还通过c-Src/PKC/MAPK细胞信号转导途径调节血管平滑肌细胞的增生［6］，还可以通过激活PKC与MAPK增加细胞内钙离子浓度［7］。RUII是大鼠离体肺动脉干的有效收缩剂，并且其收缩作用可被MAPK阻断剂PD98059所阻断［7，8］，形成肺动脉高压后，肺动脉干对RUII的收缩反应增强［9］。因此，研究RUII收缩肺动脉效应与PKC通路的关系，对于阐明RUII对肺动脉的作用机制以及在肺动脉高压形成与等病理过程中所起的作用有着重要意义。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料 

　　雄性Sprague-Dawley 大鼠(350～450g)用戊巴比妥钠麻醉后，分离出肺动脉干，剔除周围结缔组织后切成3-4mm动脉环,垂直悬挂在含15ml Kreb's 液的浴槽中。Kreb's液成份（单位为mmol/L）: NaCl 18.4,KCl 4.7, KH2PO4 1.2,MgSO4 1.2,CaCl2 2.5,NaHCOＳ3 25,glucose 11 ，EDTA 23μmol/L。 Kreb's液pH 7.4，温度(37±1)℃，并持续通含95%O2～5%CO2的气体。血管环在最适前负荷（1.0g）下平衡90min后加入60mmol/L浓度的KCl。浴槽中的液体每隔30min换一次。平衡结束后，先用60 mmol/L KCl预收缩血管环。经过反复冲洗待血管张力回至基线后，向浴槽加入新鲜配制的RUII,使最终浓度为10nmol/L，血管环的张力变化通过张力换能器用多道生理记录仪记录。药品RUII购自sigma，用1mmo/1L醋酸盐母液用蒸馏水保存在-20℃条件下，H-7(购自sigma)溶解在DMSO（二甲基亚砜）中，其余试剂均达到分析纯水准。所有试剂均在实验当天配制，避光保存在冰箱中。

　　1.2  方法 

　　在RUII（10nmol/L）预收缩大鼠离体肺动脉干环达到坪台期后，向浴槽内加入累积浓度H-7(0.1～100μmol/L)，每隔5min加一次药，观察PKC通道阻断剂H-7对大鼠RUII预收缩血管的舒张效应。

　　1.3  统计学分析 

　　根据不同药物浓度下的血管舒张值制备剂量-效应曲线，在每次实验中分别计算抑制血管收缩值的百分数，最后的值用（x±s)表示，EC50与Emax值用Scatchar法将浓度-效应曲线转化为直线后通过回归运算求得。计算公式为E=C×EmaxC×EC50，E为舒张效应值，C为药物浓度，EC50为达最大舒张反应一半所需药物浓度，Emax为最大舒张幅度。

　　2  结果

    PKC通道阻断剂H-7呈剂量依赖性舒张RUII (10nmol/L)预收缩的大鼠肺离体主动脉环。-log［EC50］=5.26±0.36(n=13), Emax =(97.21±17.86)%。见表1和图1。表1  H-7对大鼠尾加压素-Ⅱ收缩血管的影响(略) 注：n=130；不同H-7浓度舒张幅度比较，r＝0.858，P＜0.01

　　3  讨论

    本研究证实PKC通道阻断剂H-7呈剂量依赖性舒张RUII (10nmol/L)预收缩的大鼠肺离体主动脉环，-log［ＥＣ５０］=5.26±0.36、Emax=(97.21±17.86)%，提示RUII收缩肺动脉干部份通过PKC细胞信号转导通路介导，与相一致，即RUII收缩大鼠胸主动脉可被PKC通道阻断剂Chelrythrine及NPC-15437部份阻断［5］。
        
　　自从发现RUII是迄今为止最强效的血管收缩活性肽后，国内外针对RUII收缩分离自各种物种离体血管环的效应做了大量研究，尤其是在其动脉收缩效应的细胞信号转导通路机制方面。目前已发现RUII与多条细胞信号转导通路相关，从而逐步揭示RUII的生物学效应作用机制，进而揭示其在病理生方面的作用机制［５，８，１０］。然而以往对RUII收缩血管效应研究多集中在胸主动脉等大血管上，有关RUII对肺动脉干的效应及其细胞信号转导通路少有报道。已知，RUII不但是最强效的血管收缩物质，还是强有效的血管舒张剂，有报道RUII可以舒张分离自人体的肺小动脉环［11］，因此，研究RUII对肺动脉的效应以及其相关的细胞信号转导通路对于揭示RUII对肺动脉的作用机制方面，特别是在相关疾病如肺动脉高压的形成与过程中的病理生理学作用方面，显得很有必要。

    作者此前的研究［8］，证实RUII是大鼠离体肺动脉干环的强效血管收缩剂：-log［EC50］=7.95±0.40, Emax =(14.28±6.34)%(以60mmol/L KCl的收缩幅度为100%)，并首次证实其收缩效应部份通过MAPK介导。本研究结果表明RUII收缩大鼠肺动脉干环部份通过PKC通路介导，结合RUII通过PKC，MAPK细胞信号转导通路调节血管平滑肌细胞增生［８］。

    相信通过未来进一步的研究，可以逐渐揭示RUII在诸如低氧肺动脉高压等相关病理生理过程中的作用机制。

资助基金项目：浙江省厅  基金20020468号

【文献】
  　　1 Pearson D, Shively JE, Clark BR,et al. Urotensin II: a somatostatin-like peptide in the caudal neurosecretory system of fishes.Proc Natl Acad Sci USA，1980，77(8):5021～5024.

　　2 Coulouarn Y, Lihrmann I, Jegou S, et al.Cloning of the cDNA encoding the urotensin II precursor in frog and human reveals intense expression of the urotensin II gene in motoneurons of the spinal cord.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(26):15803～15808.

　　3 Liu Q, Pong SS, Zeng Z， et al.Identification of urotensin II as the endogenous ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR14.Biochem Biophys Res Commun，1999，266(1):174～178.

　　4 Ames RS, Sarau HM, Chambers JK, et al. Human urotensin-II is a potent vasoconstrictor and agonist for the orphan receptor GPR14.Nature，1999，401:282～286.

　　5 Sauzeau VL， Mellionnec E, Bertoglio J，et al. Human urotensin II-induced contraction and arterial smooth muscle cell proliferation are mediated by RhoA and Rho-kinase.Circ Res，2001，88(11):1102～1104.

　　6 Watanabe T, Pakala R, Katagiri T，et al. Synergistic effect of urotensin II with mildly oxidized LDL on DNA synthesis in vascular smooth muscle cells.Circulation，2001，104(1):16～18.

　　7 CHEN Ya-hong, ZHAO Ming-wu, YAO Wan-zhen，et al.The signal transduction pathway in the proliferation of airway smooth muscle cells induced by urotensin II.Chinese Medical Journal，2004，117(1):37～41.

　　8 陈少贤，薛必成，龚永生，等. 大鼠加压素-II收缩大鼠肺动脉干与MAPK相关. 病理生理杂志， 2003,19(10):1365～1368.

　　9 MacLean MR, Alexander D, Stirrat A，et al. Contractile responses to human urotensin-II in rat and human pulmonary arteries:effect of endothelial factors and chronic hypoxia in the rat.Br J Pharmacol，2000，130(2):201～204.

　　10 Bottrill FE, Douglas SA, Hiley CR, et al. Human urotensin-II is an endothelium-dependent vasodilator in rat small arteries.Br J Pharmacol，2000，130(8):1865～1870.

　　11 Stirrat A, Gallagher M, Douglas SA, et al. Potent vasodilator responses to human urotensin-II in human pulmonary and abdominal resistance arteries.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2001，280(2):925～928.