硫化氢对大鼠离体心脏低温保存效果的实验研究
作者：白崇峰，崔勤，李亮，李彤
【摘要】 目的 观察硫化氢（H2S）对大鼠离体心脏的保护作用。方法 将48 只SD大鼠随机分成对照组（ST组）和实验组（HST组），每组24只，分别采用St.Thomas Ⅱ液和St.Thomas Ⅱ液+H2S为停搏液及保存液，保存心脏4 h，6 h，8 h。采用Langendorff心脏灌注和工作模型装置进行心脏保存前及保存后再灌注30 min心功能测定,比较心功能恢复率、心肌含水量、心肌酶［乳酸脱氢酶（LDH）及磷酸肌酸激酶（CK）］漏出量以及心肌组织超微结构变化。结果 保存4 h、6 h后，HST组心功能指标及心肌含水量与ST组差别无统计学意义，但心肌酶漏出量明显减少；保存8 h后HST组所测各指标均优于ST组。结论 加入H2S的St.Thomas Ⅱ液可以提高大鼠离体心脏的保存效果。
【关键词】 硫化氢；心脏移植；器官保存；大鼠
Abstract: OBJECTIVE To observe the protective effects of hydrogen sulfide on isolated rat hearts. METHODS Forty-eight SD rats were randomly assigned to two groups : control group(ST group，n=24) , the hearts were arrested with St.Thomas Ⅱ solution and preserved in the same solution;study group（ HST group，n=24）,the hearts were arrested with St.Thomas Ⅱ plus hydrogen sulfide (H2S) solution and preserved in the same solution. All rat hearts were preserved for 4 h, 6 h and 8 h with 4℃ hypothermia, and underwent 30 min reperfusion (37 ℃).The isolated hearts were perfused on the Langendorff perfusion apparatus for functional evaluation before and after preservation. Myocardial enzyme leakage，wet weights in myocardium and cardiac ultrastructure were measured after reperfusion. RESULTS After the hearts were preserved for 4 h and 6 h, the differences of the recovery of myocardial function and wet weights in myocardium were insignificant，but the differences of creatine kinase(CK) and lactic dehydrogenase (LDH) were significant between HST and ST group. After the hearts were preserved for 8 h, the differences of all target measured were significant between HST and ST group.CONCLUSION Addition of H2S into the St.Thomas Ⅱ solution could enhance the myocardial protective effects to the isolated rat hearts.
Key words： H2S；Heart transplantation；Organ preservation; Rat
随着国内外心脏移植的,供心不足及供心保存时限短严重制约了其进一步发展。迄今为止, 供心的冷保存时限仍被限制在4～ 6 h 以内［1］。加强供心保护，提高供心保存时限和保存质量，对移植手术的成败具有重要意义。
近年来实验证明，内源性H2S与一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）相似,是体内气体信号分子［2］，同时，还是一种KATP通道开放剂（PCOs）［3-4］。Eric等［5］实验证明，外源性H2S可导致小鼠出现“类假死”（suspended animation-like）状态，中心体温、代谢率、氧耗量均大幅度下降。设想用H2S作为心脏保存液的添加成分会产生较好效果，本实验采用Langendorff 离体大鼠心灌注模型, 在St.Thomas Ⅱ液中添加H2S的供体NaHS，选择不同的保存时间做比较，对H2S在心脏保存中的作用进行初步的探索。
1 材料与方法
1.1 保存液的配制 对照组（ST组）为St.Thomas Ⅱ停搏液及保存液，具体组成成份：NaCl(120 mmol/L),KCl(16 mmol/L)，MgCl2(16.6 mmol/L)，CaCl2(1.2 mmol/L)，NaHCO3(10 mmol/L)，pH 7.8，渗透压295～296mOsm/L。实验组（HST组）采用St.Thomas Ⅱ液+H2S为停搏液及保存液，含4×10－1mmol/L NaHS（约相当于10倍生理浓度）的St.Thomas Ⅱ液，NaHS由HCl和Na2S在使用前临时配制。
1.2 实验分组 健康SD大鼠48 只，雌雄各半，体重180～220 g ，随机分成ST组和HST组，每组24只，分别保存心脏4 h，6 h，8 h（每个保存组8只）。
1.3 离体心脏灌注模型 大鼠称重后,戊巴比妥钠（65 mg/kg）腹腔内注射麻醉，尾静脉注射质量浓度为10 g/L的肝素抗凝（0.12 ml/只）。剪开胸骨，迅速切取心脏，放入0℃～4℃ K－H 液中，冲洗残留在主动脉内的血液,迅速移至Langendorff灌注装置上，用37℃（95% O2 和5%CO2 预充30 min）K－H液顺行灌注,灌注压维持在90 cmH2O，肺动脉根部切开,使冠状动脉回流液充分引流。从开胸到开始灌注的时间保持在70 s以内。灌注5 min后，切开左心耳,经左心房、二尖瓣,将连接有测压导管的心室球囊送入左心室，另一端连接多导生理记录仪。往心室球囊内缓慢注射适量生理盐水（40～60 μl），使左心室舒张末压保持在10 mmHg。15min左右待心脏搏动达到稳定状态，测定血流动力学基础值，30 min后,逐渐降低灌注温度至30℃以下，按分组经主动脉根部分别灌注4℃的心脏保存液（80 ml/kg）使心脏停跳，在相应的保存液中分别保存4 h（n=8）、6 h（n=8）、8 h（n=8）后，重新开始心脏灌注，逐渐恢复灌注温度至37℃。约15～20min后，心脏搏动可达到稳定状态。复灌30 min后测定心功能和冠状动脉流出量，恢复率，留取冠状静脉流出液备用。心脏灌注60 min后，在左心室上取一块约300 mg心肌组织，保证每次切取位置尽可能一致，称重后放入80℃的烘箱中烘烤24 h,再次称重，计算心肌含水量。
1.4 检测指标 ①心功能测定：检测心率（HR）、冠脉流量（CF）、左心室收缩峰压（LVSPP）、左心室内压最大上升速率（+dp/dtmax），恢复率按（保存后数值/保存前数值）×100％计算。②心肌酶漏出量：分别留取复灌过程中第30 min 时的冠脉流出液，用全自动生化分析仪测定其中乳酸脱氢酶（LDH）及磷酸肌酸激酶（CK）的含量。③留取的左心室前壁的心肌，用滤纸拭干，称重后置于80℃烘箱中烘烤24 h，再次称重。心肌含水量按(湿重－干重)/湿重×100%计算。④心肌超微结构：实验结束后，各组取1只心脏，切取左室乳头肌置入3%戊二醛溶液中制备电镜标本,观察各组心肌超微结构的改变。
1.5 数据处理 统计分析应用SPSS 13.0软件，数据均以( ±s )表示，采用t检验对各组数据进行比较，P＜0.05为有显著统计学意义。
2 结果
2.1 心功能指标的变化 心功能指标随保存时间延长逐渐降低。HST组与ST组CF心脏保存4 h后无明显差别（P＞0.05），6 h、8 h后有明显差别（分别为P＜0.05，P＜0.01）；HST组与ST组LVSPP和＋dp/dtmax的恢复率保存4h、6h无差别（P＞0.05），8h 有明显差别（P＜0.05）；HST组保存8 h与ST组保存6h各指标对比无明显差别（P＞0.05），见表1。
2.2 心肌含水量变化 心肌含水量随保存时间延长逐渐增加。心脏保存4 h、6 h HST组与ST组心肌含水量比较无明显差别（P＞0.05）；保存8 h HST组与ST组心肌含水量比较有明显差别（P＜0.01）；HST组保存8 h与ST组保存6 h的心肌含水量比较，无明显差别（P＞0.05），见表2。
2.3 心肌酶（CK，LDH）漏出量 心肌酶（CK，LDH）漏出量随保存时间延长而逐渐增加。保存4 h、6 h、8 h后，HST组与ST组CK、LDH漏出量比较均有明显差别(P＜0.01)；HST组保存8 h与ST组保存6 h CK、LDH漏出量比较无明显差别（P＞0.05），见表2。
表1 心脏保存不同时间后心功能恢复率情况（略）
注：同一保存时间HST组与ST组比较，*P< 0.05，**P< 0.01
表2 心脏保存不同时间后心肌含水量、心肌酶漏出量的情况（略）
注：同一保存时间HST组与ST组比较，*P<0.05，** P< 0.01
2.4 心肌电镜观察 HST组与ST组心脏保存4 h心肌电镜观察无明显差别：心肌结构清晰，心肌间连接完整，肌丝排列整齐，肌节结构清楚。线粒体形态、大小正常，无明显肿胀，嵴正常，细胞无明显水肿，细胞核正常（图1）。HST组心脏保存6 h：结构正常，肌丝排列整齐，肌节结构清楚，无明显水肿，线粒体较4 h组略大，部分线粒体略显肿胀。个别细胞轻度水肿，细胞内间质增宽，细胞核正常。ST组：结构尚可，肌丝排列基本整齐，偶见肌节结构破坏，肌丝破裂，可见轻度水肿，线粒体肿胀，部分线粒体可见峭融合。细胞水肿，细胞内间质增宽。细胞核基本正常（图2）。HST组心脏保存8 h：心肌结构尚清楚，部分肌纤维排列紊乱，偶可见肌节结构破坏、肌丝断裂。线粒体轻度肿胀，出现嵴融合，嵴间隙增宽，细胞内轻度水肿，密度略降低。ST组表现更为明显，肌纤维排列紊乱，肌节结构破坏，肌丝破裂溶解较多。线粒体肿胀明显，嵴扩张肿胀，空泡化。心肌细胞内水肿明显，电子密度降低。部分胞核出现异染色质（图3）。
3 讨论
本实验发现，将H2S加入心脏保存液中可明显改善冷保存后心功能的恢复，减少心肌酶漏出量及心肌水含量，心肌的超微结构也能得到较好的保护。
图1 ST组（上）、HST组（下）保存4h 心肌超微结构的变化(×12000) （略）
图2 ST组（上）、HST组（下）保存6h 心肌超微结构的变化(×25000) （略）
图3 ST组（上）、HST组（下）保存8h 心肌超微结构的变化(×12000) （略）
这表明在传统的St.Thomas Ⅱ液配方中加入H2S后，心脏功能、心肌结构可以得到较好的保护，心脏保存时间能明显延长，显示出更好的保存效果。
目前常用的心脏保存液为高钾保存液，在短时间的心肌保护和心脏保存中可以获得较好的保护效果，但高钾去极化保存液会启动离子泵，消耗能量，引起钙超载，细胞膜通透性增加，从而引起难以克服的心肌缺血，再灌注损伤及冠状动脉内皮细胞损伤，高钾对心肌微血管形态、心脏水肿、超微结构均产生不利影响［6］。Zhao等实验证明H2S是一种KATP通道开放剂［4,7］，通过兴奋KATP通道,增加KATP通道的电流,使细胞膜出现超极化而使平滑肌舒张。该实验结果已被全细胞膜片钳实验所证实。我们认为，H2S作为KATP通道开放剂可以通过开放KATP通道，使钾离子外流增加，造成心肌细胞膜的超极化，心肌细胞去极化时间延长，钠离子内流减少；同时，由于钾离子外流，可抑制钙离子内流，防止细胞钙超载，使心肌快速停跳，减少ATP消耗，使ATP在冷冻期间更多地被利用在维持细胞内自身平衡，保护了细胞跨膜离子梯度、胞内的能量储备及细胞的完整性，能有效的防止心肌损伤［8］。传统观点认为，H2S作为细胞色素C氧化酶的抑制剂，阻断呼吸链，造成细胞损伤，但在离体低温保存状态下微量H2S可抑制组织器官的氧化磷酸化，造成代谢明显下降，无氧酵解产生的ATP可以维持细胞的消耗，从而保护线粒体功能，防止能量储备耗竭。这对改善缺血后心肌组织能量代谢有积极作用，因而可延长心脏的保存时间。H2S可单独或与NO协同作用引起冠状动脉舒张，增加血流，改善复灌后冠脉的微循环，减少心肌缺血/再灌注损伤，促进心脏功能的恢复，减少心肌细胞的凋亡［9-10］。另外，H2S在体内以H2S和NaHS形式存在［3］，二者形成动态平衡，以此维持H2S在体内的稳定，还可以缓冲内环境pH值水平，防止LDH生成过多造成的酸中毒。本实验通过在St.Thomas Ⅱ液中加入H2S的供体NaHS，进一步证实了H2S对心肌的保护作用。
总之，我们认为H2S不仅具有PCOs的作用，还具有降低代谢，增加心肌能量储备的功能。在传统的St.Thomas Ⅱ液中加入H2S后，结合低温措施保存心脏，既能够保留高钾及低温能使心脏迅速停搏，减少心肌能量的消耗，有利于心肌保护的优点,又能最大限度地减轻其不良作用,从而延长了心脏保存时间,增强了心肌保护效果。至于H2S的最佳作用浓度尚需进一步实验探讨。
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