生物蛋白胶外支架预防移植静脉早期损伤的实验研究

                作者：万力,江鹏飞,高涛,万于华,刘季春 

【摘要】  目的 以生物蛋白胶作为外周支持，研究其对兔移植静脉的影响，从而寻找更适合临床的外支架材料。方法 24只雄性新西兰大耳白兔随机分为非支架组（NS组 n＝12）和生物蛋白胶支架组（FS组 n＝12）。建立兔颈外静脉颈总动脉旁路移植术模型。FS组给予生物蛋白胶作为外支架。术后28天取出移植静脉，进行超微结构、组织病理分析和免疫组织化学分析。结果 超微结构显示与NS组相比，FS组移植静脉损伤程度明显减轻。免疫组化结果显示与NS组相比，FS组移植静脉细胞增殖核抗原表达明显受到抑制；NS组内皮层损伤严重，有淋巴细胞侵润，而FS组内皮层则几乎完好无损（P<0.01）；在NS组平滑肌细胞增殖活跃且向内膜迁移，FS组平滑肌细胞增殖受到抑制，且向外膜迁移；在FS组移植静脉外膜有丰富的成熟微小血管网形成，但是在NS组，微小血管数量则非常少。结论 生物蛋白胶外支架能给兔移植静脉提供足够的外周支持，明显缓解移植静脉植入动脉循环后的早期损伤。该作用与保护血管内皮完整、抑制增殖细胞核抗原表达、促使平滑肌细胞向外膜迁移和形成外膜新生血管网有关。

【关键词】  生物蛋白胶;外支架;移植静脉;增殖细胞核抗原

    Fibrin Glue as External Support Prevents Vein Graft Early Injury

    Abstract: OBJECTIVE   To investigate the effect of fibrin glue on preventing vein graft failure as perivenous application and explore a novel alternative external support.  METHODS  24 New Zealand male rabbits were divided into non-supported group (NS group) (n=12) and fibrin glue group (FS group) (n=12). All animals underwent unilateral jugular vein into common carotid artery interposition grafting and then fibrin glue was applied as perivenous support. Samples of tissues were harvested after 4 weeks and histological and immunohistochemical analysis were underwent. RESULTS  Compared with NS group, an obvious relief of ultramicrostructure were showed in vein grafts of FS group. The vein grafts with perivenous support by fibrin glue demonstrated a statistically decrease in neointimal and medial hyperplasia compared with non-supported vein grafts（P<0.01）. Immunohistochemical analysis showed that the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was inhibited significantly in FS group compared with NS group. Almost intact endothelium was showed in FS grafts（P<0.01）. But in NS grafts there were severe endothelium damages where lymphocytes infiltrated. In NS grafts, the smooth muscle cells were hyperplasia and migrated to intimal, whereas in FS group, the hyperplasia of smooth muscle cells were inhibited and migrated to adventitia. We also observed the FS grafts were associated with a profound network of matured microvessels, but in NS grafts they were far less numerous. CONCLUSION  Perivenous application of fibrin glue has beneficial effects on lessening early injury of vein grafts. These effects are related to intact endothelium, inhibition of PCNA expression, adventitial migration of SMC and formation of numerous microvessels.

    Key words：  Fibrin glue;External support;Proliferating cell nuclear antigen;Vein graft

    大隐静脉目前仍然是冠状动脉旁路移植术中最常用的血管，因其易于取材，长度足够，口径较大。但是由于10年通畅率仅为50％左右，长期效果不如乳内动脉［1］。目前认为自体静脉移植物植入动脉循环后，在动脉流体力学作用下，由于动脉循环的高压力和高流速，静脉移植物管壁张力增高，剪切力增大，在此条件下，移植物发生适应性改变，最终导致内膜增生，血管再狭窄［2］。

    近来国内外许多研究均致力于探索各种办法避免或减少移植静脉再狭窄。有许多动物实验和体外模型显示［3］，在静脉暴露于动脉压力之前就予以各种血管外周支持，有利于减轻移植物的急性期损伤，改善移植物对动脉循环的适应性。现已有研究证实非限制性的、生物可吸收材料外支架能够有效的抑制静脉桥内膜增生［4］。但是这些材料在临床应用上仍然存在构建难、使用不方便等缺点。寻找更好的外支架材料是目前这类研究的热点。从特性来看，生物蛋白胶可能是一种非常理想的替代材料［5］。本研究将建立兔颈静脉颈总动脉旁路移植模型，研究生物蛋白胶作为外支架能否预防移植静脉的早期损伤。

    1  资料与方法

    1.1  实验动物和分组  健康纯种雄性新西兰大耳白兔，由医学院药品和生物制品检定所动物部提供，体重2500～3000 g，饲养环境符合国家实验动物二级标准。手术过程在无菌条件下进行。按照有无生物蛋白胶血管外支持，分为支架组（FS组）、无支架组（NS组），每组１2只动物。

    1.2  实验方法  提前从冰箱取出生物蛋白胶，在常温下复温，分别用不同的注射器配制生物胶主体溶液和催化剂溶液。然后将配制好的生物胶主体溶液和催化剂溶液分别注入推液器上的注射器内。给动物肌注氯胺酮（30 mg/kg）诱导，肌肉注射2%戊巴比妥（30mg/kg）维持麻醉，200 U/kg肝素静脉达到半肝素化。颈部正中切口，截取2.0 cm颈外静脉，修剪静脉段两端，将其倒转，两端分别与颈总动脉断端用8-0无创缝线行间断外翻端－端吻合。吻合完毕后将远心端无创血管夹开放，回血使静脉桥充盈至状态，此时支架组给予生物蛋白胶（约0.8 ml）于静脉桥外周均匀喷洒，15　min后待蛋白胶凝结， 于术后第28天取材。

    1.3  检测指标和结果判断  将标本分为两部分，分别置于3.8%戊二醛溶液中和中性4％多聚甲醛中固定，行超微结构观察和组织病理和免疫组化观察。①内膜评分在光镜下观察内膜内皮细胞染色表达情况。根据内膜缺失所占整个内膜的百分率评分［6］，评分如下：0分，内皮完整、无缺失；1分，内膜缺失率<10%；2分，内膜缺失率10%～25%；3分，内膜缺失率25%～50%；4分，内膜缺失率>50%；②PCNA指数：PCNA定位于细胞核内，呈细颗粒状棕黄色沉淀。×400光镜下，计数单位视野阳性细胞数占总细胞数百分比，每例切片随机10个400倍视野中的PCNA平均数即为PCNA指数。

    1.4  统计学分析     实验数据使用SPSS 10.0软件包进行统计学分析，所有数据以均数±标准差(±s)表示。组间比较采用t检验。内膜评分比较采用卡方检验。P＜0.05为差别有显著意义，P＜0.01为差别有高度显著性意义。

    2  结  果

    2.1  一般情况  实验过程中无实验动物死亡。吻合口完成时各吻合口均通畅。术后第28天NS组有3例静脉桥阻塞，而FS组静脉桥均通畅。NS组静脉桥外观膨胀明显，而FS组静脉桥仅轻微膨胀，此时生物蛋白胶在移植物外周仍清晰可见。

    2.2  移植静脉的组织病形态变化  NS组血管壁增厚，管壁苍白，血管平滑肌细胞增殖，增生的平滑肌细胞排列紊乱，内膜下血管平滑肌细胞增多，未见平滑肌细胞向外膜迁移（图1A）。同时还有成纤维细胞增殖，内膜内皮细胞层完整性破坏，内皮细胞缺失，部分内膜脱落，在内膜破坏严重处有附壁血栓性形成，移植物血管水肿,有大量中性粒细胞侵润，管壁有薄层附壁血栓(图2A)。血管外膜未见有微小血管形成(图3A)。 FS组静脉移植物管壁红润，与周围组织粘连极轻。平滑肌细胞染色可见增生的平滑肌细胞排列整齐、，且平滑肌细胞可以观察到向血管外膜迁移(图1B)。血管内皮完整（图2B）。血管外膜可见丰富的微小血管形成，这些血管靠近中膜，且管腔内充满血细胞(图3B)。

    2.3  透射电镜  FS组结构基本保持完整，中层平滑肌细胞细胞器较少，大多数细胞胞浆内含丰富的肌丝，细胞器较少，细胞核呈椭圆形，核膜光滑，核中染色质散在分布，典型凋亡细胞罕见（图4A）。NS组结构破坏严重，在血管内膜和中层可见大量细胞胞浆中细胞器丰富，粗面内质网、高尔基器、线粒体较多，胞核形状不规则，核染色质边集，核固缩、断裂，胞浆凝集、空泡化，肌丝和致密体减少，细胞核呈新月形改变，细胞膜完整，周围无炎性细胞浸润；在增生的平滑肌细胞周围有较多胶原纤维（图4B）。

    2.4  移植物内皮细胞染色观察和评分比较  通过光镜观察，在NS组，内膜层破坏严重；在FS组，内膜层基本保持完整。两组内膜评分见表1。

    2.5  PCNA染色观察和指数比较  术后28天，NS组PCNA阳性细胞显著增多，主要位于内膜和中膜(图5A)；而FS组PCNA阳性细胞增加不明显(图5B)。二者PCNA指数比较有显著差异。 表1  术后第28天静脉移植物内膜缺失评分比

    3  讨  论

    自体大隐静脉移植仍然是目前冠状动脉旁路移植术最常用的移植血管，但由于移植静脉内膜增生所引起的血管再狭窄，远期通畅率下降，使其临床应用受到限制。大组临床回顾资料显示大隐静脉移植物10年的通畅率不超过50％［1］。而利用内乳动脉、桡动脉、胃网膜右动脉等动脉材料，其通畅率则明显增高［7］。由于静脉所处流体力学环境明显不同于动脉，静脉的结构与功能和动脉也完全不同［8］。 针对静脉移植物植入动脉循环后力学因素在内膜增生所起的作用，许多研究致力于血管外周支持是否可减少静脉移植物内膜增生。但直到1978年，外周支持可减少移植静脉管壁增生才被Karayannacos等所发现［9］。血管外周支持按其材料性质可分为非降解性和可降解性，按其口径大小可分为限制性和非限制性［10］。采用聚四氟乙烯（PTFE）、涤纶材料（Dacron）或不锈钢材料的限制性外周支持对静脉移植物内膜增生的影响目前仍有争议［11］。Violaris等发现在猪模型中，限制性外支架虽然能抑制移植静脉中膜增生，但是内膜增生反而更加明显［12］。研究表明这些支架会降低静脉壁弹性，并使外膜血液供应中断，从而刺激血管内膜增生［13］。近来，越来越多的研究结果表明，非限制性外周支持能够更加有效的减少静脉移植物内膜和中膜的增生。研究表明该类支架在静脉植入动脉循环后，可以允许静脉一定程度的扩张，随后，外周支持能够逐渐融入血管组织而形成“新外膜”。这样，静脉移植物横截面积增大，内膜和中膜增生程度减轻，并不受外支架口径的限制，从而避免为了精确口径匹配所造成的临床操作困难［14］。为了避免非降解材料可能导致的慢性炎性反应、感染、纤维化等问题，生物可吸收材料外支架受到越来越多的重视，且研究结果令人满意［4,15］。

    生物蛋白胶是模拟人体自身凝血反应最后阶段而起作用的一种生物工程产品,已广泛用于皮肤移植，神经和血管的吻合，心脏、肝、肺和脾组织等的外科手术中［16］。从理论上分析，生物蛋白胶可以提供对静脉外周支持作用［17］。生物蛋白胶具有以下优点：可塑性好，能够自动适应静脉的形状,与静脉口径匹配，且为非限制性，允许静脉移植物早期一定程度的扩张；可降解，在体内的存在是一过性的，避免了其他非降解性支持物可能引起相关副作用的风险，在本研究中所使用的生物蛋白胶，在体内1～2月能完全降解；能够止血，减少吻合口出血等。此外，其使用方便，适用于临床需要，能够避免目前其它材料外支架使用时的繁琐步骤。本实验研究结果显示：在兔颈静脉至同侧颈动脉自体移植动物模型上，在静脉移植物外周给予生物蛋白胶作为支持能够提供足够的外周支持，明显缓解移植血管管壁的损伤性反应，达到保护移植静脉目的。通过CD34作内皮细胞染色标记，我们发现，NS组移植血管内膜内皮细胞层完整性破坏，内皮细胞缺失，部分内膜脱落，在内膜破坏严重处有附壁血栓形成，而FS组内皮细胞完整性得以保持，无附壁血栓形成。这表明生物蛋白胶外周支持能够保护移植血管内皮层完整，从而抑制内膜增生。PCNA最初是作为一种核抗原，细胞循环进入S期时表达，而处在G0/G1期的细胞则基本不表达［18］，为细胞增殖的标志［19］。本实验结果显示，生物蛋白胶外支架可通过抑制PCNA表达来抑制移植静脉内膜和中膜增生程度，从而达到抗静脉移植物再狭窄之目的。

    平滑肌细胞的增生和向内膜迁移是静脉移植血管再狭窄的关键因素［20］。通常，完整的基质可以通过特定的信号传导通路、结合可能促进细胞迁移的生长因子以及自身形成结构屏障等几方面，使平滑肌细胞处于静止期，从而抑制其迁移［21］。当静脉血管植入动脉循环后，基质破坏降解，不仅其结构屏障受到破坏以及相关生长因子的释放引起平滑肌细胞向内膜迁移，且基质降解产物自身对平滑肌细胞有趋化作用，促进平滑肌细胞向内膜迁移［22］。纤维蛋白并不是惰性物质，有报道表明纤维蛋白及其降解产物能够促进细胞迁移［23］。本实验结果显示，NS组平滑肌细胞增生明显，且明显向内膜迁移，血管外膜未见平滑肌细胞；而FS组平滑肌细胞增生明显减弱，且向外膜迁移明显。由此我们推测，静脉移植血管外周给予生物蛋白胶作为外周支持，不仅可以维持组织基质的完整，且其降解产物对平滑肌细胞具有趋化作用，促使平滑肌细胞向外迁移，从而抑制内膜增生，达到抗狭窄之目的。在本实验中，我们还观察到，在FS组移植血管的外膜，有丰富的微血管网形成，这些血管主要位于靠近中膜的位置，且管腔内充满血细胞，表明这些微血管为成熟的新生外膜滋养血管，结合入整体循环中。而在NS组移植血管中，并未见微血管网形成。我们认为，正是由于外膜微血管网的形成，改善了静脉移植物缺氧的状态，使内膜增生得以抑制［12］。外膜微血管网的形成可能是由于生物蛋白胶外支架为非限制性，其降解产物引起吞噬细胞、巨细胞、单核细胞等聚集，释放血管生长因子所致。

    4  结  论

    4.1  术后28天，在兔颈静脉至同侧颈动脉自体移植动物模型上，与NS组相比，外周给予静脉移植物生物蛋白胶作为外周支持能够明显缓解移植血管内膜和中膜增生，达到保护移植静脉的目的。

    4.2  生物蛋白胶外支架保护机制与其可以调节静脉移植物的应力状态，保持移植物内膜完整，抑制PCNA增生有关；生物蛋白胶及其降解产物对平滑肌细胞的趋化作用和移植物外周微血管网的生成可能对静脉内膜和中膜增生有一定的抑制作用。

【】
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