OGDC?E2和BCOADA?E2的二联体检测在原发性胆汁性肝硬化中的意义
作者：陈燕，娄加陶，姚定康，周晔，吴传勇，钱琤，蒋天舒，陈 波，仲人前，邓安梅
【摘要】 目的 通过重组表达抗原OGDC?E2和BCOADC?E2的二联体融合蛋白(B0)，并用于检测自身抗体及临床意义。方法 重组表达的融合蛋白(B0)，通过Ni?NTA亲和柱纯化，经过免疫印迹法(IBT)和酶链免疫吸附(ELISA)法检测56份PBC患者血清，以48份自身免疫病患者、50份其他肝病患者、70例正常人血清为对照组。结果 56例确诊的PBC患者中，42例阳性，阳性率为75．0%。而健康体检者和疾病对照组血清中的M2抗体均为阴性。结论 通过用重组表达的二连体B0检测PBC患者血清中的M2抗体，具有一定的特异性及敏感性，为临床进一步研究PBC，辅助诊断提供一些辅助。
【关键词】 BCOADA?E2?OGDC?E2二联体(B0)；免疫印迹；酶联免疫吸附试验；原发性胆汁性肝硬化
原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是以进行性胆汁淤积伴有肝损伤为特点，并逐渐形成肝硬化及其并发症。其肝组织病变特征是以淋巴细胞为主的大量炎性细胞浸润，肝内小叶间胆管的慢性非化脓性破坏性胆管炎，最终为肝硬化甚至肝功能不全。血清线粒体抗体M2(AMA?M2)诊断PBC的敏感性和特异性均超过90%~95%，为本病最突出的免疫学指标异常，也是重要的诊断手段[1]。M2抗体的靶抗原主要为线粒体上的2?氧酸脱氢酶复合体(2?OADC)的其中一些组分：侧链二氧酸脱氢酶复合体E2(BCOADC?E2)、丙酮酸脱氢酶复合体E2(PDC?E2)、2?氧戊二酸脱氢酶(OGDC)[2~3]。我们通过采用重组抗原(BCOADC?E2)和2?氧戊二酸脱氢酶(OGDC)的复合体BO来检测M2抗体，以利于PBC的早期诊断。
1 材料和方法
1．1 标本来源
PBC患者组56例，为本院2004年8月—2006年6月间，经住院检查确诊的PBC患者。其中女54例，男3例，男女比例为1：18。年龄32~65岁。并且PBC的诊断符合2000年美国肝脏病学会(AASLD)推荐的诊断指南：排除甲、乙、丙、戊、庚型病毒性肝炎；肝功能异常，有胆汁淤积的生化改变(主要是碱性磷酸酶、γ?谷胺酰转肽酶升高)且无其他原因解释；血清抗线粒体抗体或M2抗体阳性， 同时AMA≥1：40[4]。 患者并行穿刺病理检查，汇管区有大量淋巴细胞、嗜酸粒细胞聚集，光镜下可见小叶结构完整，实质内可见凋亡小体形成及散在点状坏死，均符合PBC早期病特征。70例正常对照均为本院的健康体检者，50例其他肝病患者和自身免疫病患者48例(类风湿性关节炎15例，系统性红斑狼疮20例，强直性脊柱炎3例，自身免疫性胆管炎10例)为疾病对照组，均为本院住院患者。
1．2 纯化重组抗原
将特异性扩增OGDC?E2和BCOADC?E2的二联体BO cDNA定向插入高效表达载体PET28a(+)，转导入宿主菌大肠埃希菌(E．coli)．BL21，经异丙基硫代?β?D半乳糖苷(IPTG)诱导后表达，在变性条件下用带6个组氨酸的Ni?NTA琼脂糖纯化，获得高纯度的重组BO，方法参见[5]。
1．3 利用重组融合抗原IBT检测M2抗体
将重组蛋白BO经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS?PAGE)电泳后，转印至硝酸纤维素(NC)膜，封闭后依次加入血清、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG，显色剂3．3?二氨基联苯胺四盐酸盐底物和H2O2，观察反应条带。同时用正常人血清作阴性对照。
1．4 ELISA法检测M2抗体
ELISA方法检测PBC患者，健康体检者和疾病对照组血清中的M2抗体。纯化后的重组蛋白，用碳酸盐缓冲液CBS(pH9．5)稀释后分别包被酶标板。OP为4 mg/L，4 ℃ 过夜(16 h)，吐温-20碳酸盐缓冲液洗涤3次后，加入小牛血清封闭，洗涤后依次加入待检血清、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG、显色剂3．3?二氨基联苯胺和H2O2，经酶标比色仪吸光度450 nm 比色，读取吸光度值，判定值为阴性对照A值+5倍标准差。
1?5 统计学处理
用StlJderlt’s检验分析均值间差异。第2期OGDC?E2和BCOADA?E2的二联体检测在原发性胆汁性肝硬化中的意义 陈 燕，等
2 结果
2．1 免疫印迹检测结果
用重组融合抗原BO经IBT检测，56例确诊的PBC阳性病人，检测出抗BO抗体阳性的为42例，阴性14例。正常对照和其他非胆汁性肝硬化患者抗BO抗体均为阴性。48例自身免疫病患者中，10位自身免疫性胆管炎患者中2例AMA阳性；但其血清中抗BO抗体均为阴性。结果见表1。表1 抗BO抗体与AMA抗体检测结果(略)
2?2 常规方法检测
采用常规方法检测， 自身免疫病患者和其他肝病患者、健康对照者中M2抗体均为阴性。而56例确诊的PBC患者中，其M2抗体为阳性42例，阴性14例；与我们采用的IBT法和ELISA法检测结果完全符合。
2?3 ELISA法检测抗BO血清
用ELISA法检测时，正常对照组值为(89±35)U，因此以>289 U(±5 s)为阳性标准，<289 U 为阴性标准。结果显示，在56例确诊的PBC患者中42例阳性，14例阴性；其他疾病对照组和健康体检者均为阴性。
3 讨论
原发性胆汁性肝硬化(PBC)的特征是血中线粒体抗体为阳性，而高滴度的抗线粒体抗体(AMA)是PBC的重要血清学指标。根据其靶抗原不同，AMA可分为M1~M9共9个亚型，其中M2对PBC的诊断最具特异性。PBC在任何年龄段均可发病，其中90%~95%为女性，大部分集中在30~70岁之间，儿童少见[6]。
AMA对PBC具有诊断意义。95%~98%的患者AMA阳性，因此抗体出现可早于临床表现多年，所以具有早期诊断价值。近年来研究显示，M2亚型对PBC具有较高的特异性和诊断价值。PBC的发病率在我国鲜见报道，近年来国外报道PBC也呈上升趋势。
1987年以来鉴定出M2靶抗原为线粒体上的2?氧酸脱氢酶复合体(2?OADC)的一些组分：丙酮酸脱氢酶(PDC)、2?氧酸脱氢酶(BCOADC)、2?氧戊二酸脱氢酶(OGDC)等，BCOADC和OGDC的抗原表位位于内酯酰区。在PBC患者血清中OGDC的阳性率为39%~88%，而BCOADC的阳性率为53%~55%[4~7]。
我们采用重组表达的BCOADC?E2和OGDC?E2的二联体BO，作为靶抗原来检测PBC患者血清中的M2抗体。56例PBC患者检查出BO抗体阳性42例，阴性的12例，其阳性率为75．0%。自身免疫病患者、其他肝病患者和健康体检者血清中均未检测出BO抗体。
通过早期检测M2抗体，有助于早期确诊PBC患者，对指导有一定价值。
【参考】
/[1/] 王 芸,范 红,郭 强. 原发性胆汁性肝硬化与抗线粒体抗体M2检测的临床意义/[J/].中华内杂志,2005,2(3):211-222.
/[2/] Van de Water J,Gersbwon M E,Leung P,et al.The autoepitope of the 74 kD motochondrial autoantigen of primary biliary cirrhosis corresponds to the functional site of dibydrolipoamide acetyltransferase/[J/].J Exp Med,1988,167:1791-1799.
/[3/] Jophn R E,Neuberger J M.Immmuopathology of primary biliary cirrhosis/[J/].Enr J Gastroenterol Hepatol,1999,11:587-593.
/[4/] Nakano T,Inoue K,Hirohara J,et al.Long?term prognosis of primary biliary cirrosis(PBC)in Japan and analysis of the factors of stage progression in asymptomatic PBC(α?PBC)/[J/].Hepatol Res,2002,22(2):250-260.
/[5/] 夏 睛,仲人前,邓安梅,等.胰腺癌相关自身抗原47原核表达、纯化及其抗体检测胰腺癌的价值初探/[J/].中华检验医学杂志,2003,26(4):222-225.
/[6/] 张 岩,白雪帆.原发性胆汁性肝硬化的研究进展/[J/].陕西医学杂志,2005,34(7):833-834.
/[7/] Joplin R E,Neuberger J M.Immunopathology of primary biliary cirrhosis/[J/].Eur J Gastroenterol Hepatol,1999,11(6):587-593.
