荧光实时定量PCR检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2肾上腺素能受体基因mRNA表达

【摘要】  目的建立荧光实时定量PCR法检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2肾上腺素能受体(AR)基因mRNA表达。方法随机选择ASAⅠ～Ⅱ级老年患者30例，分离外周静脉血淋巴细胞，采用荧光实时定量PCR法检测β1和β2?AR基因mRNA表达，并与半定量PCR检测结果进行比较。结果30例患者外周血淋巴细胞荧光实时定量PCR均检出β1和β2?AR mRNA表达，不同性别组同一基因表达量无显著差异（P>0.05）；荧光实时定量PCR检测β2?AR mRNA表达量显著高于β1?AR mRNA(P<0.001)，而半定量PCR随着循环次数增加，β1和β2?AR　mRNA表达差异减小。结论所建立的荧光实时定量PCR成功检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2?AR基因mRNA表达，有较高的灵敏性及特异性；半定量PCR扩增平台期影响试验结果判断。

【关键词】  荧光实时定量PCR β肾上腺素能受体mRNA 淋巴细胞 老年人

　　　Abstract： ObjectiveTo establish a real?time quantatitive polymerase chain reaction (PCR) method for the detection of β1?and β2?AR mRNA expression in elderly patients’peripheral lymphocytes. MethodsThirty elderly patients with ASA gradeⅠ-Ⅱwere recruited. Their blood was collected and the lymphoctes were isolated. The expressions of β1?and β2?AR mRNA were detected with fluorescent quantitative real?time PCR and semi?quantitive PCR.ResultsThere were expressions of β1? and β2?AR mRNA in all the subjects with real?time PCR, and the latter was significally more abundant than the former (P<0.001). Also, there was no difference between different genders (P>0.05). With semi?quantive PCR, the ratio of β2?AR mRNA/β1?AR mRNA decreased when the cycles increased (P<0.05).ConclusionSemi?quantatitive PCR is not perfect at the platform stage, but fluorescent real?time quantitative PCR is more accurate and sensitive than semiquantitive PCR for the detection of β1? and β2?AR mRNA expressions in elderly patients’peripheral lymphocytes.

　　Key  words： real?time polymerase chain reaction (PCR); β?adrenergic receptor; lymphocyte; elderly patient

　　人外周血淋巴细胞与心肌细胞表面β?AR密度成显著正相关［1］。以淋巴细胞为模型，间接反应各种病理生理状态下心肌细胞β?AR表达变化，被多数研究所证实。然而，淋巴细胞β?AR亚型分布存在较大争议：早期研究认为，淋巴细胞仅表达β2?AR［2］。最新研究发现，人外周血淋巴细胞存在β1、β2和β3?AR三种亚型，且β1和β2?AR mRNA丰度相近［3］。既往检测淋巴细胞β?AR基因表达多采用半定量PCR，该方法属终点检测法，比较目的基因起始拷贝量准确度较低。本研究采用荧光实时定量PCR，检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2?AR基因mRNA表达，并与半定量PCR结果比较。

　　1材料与方法

　　1.1试验对象

　　随机选择拟全麻下行择期手术的老年患者30例，其中男、女各15例，年龄65~80岁（平均73.2岁），ASAⅠ~Ⅱ级，既往无心血管系统及血液系统疾病。

　　1.2主要试剂及仪器

　　人淋巴细胞分离液（美国Sigma公司）、 TrizolTMRNA Isolation Reagent(美国Invitrogen公司)，G.oTaq、Reverse Transcription System (美国Promega公司)， SYBR Green (日本Takara公司)。BIO?RAD iCycler iQ Muhicolor Real?time PCR Detection System(美国Bio?Rad公司)； GeneAmp PCR System 2400(美国ABI公司)；高速冷冻离心机(德国Heraeus公司)；DNA电泳仪(Hoefer公司)；Fluor?S凝胶成像仪(美国BioRad公司)；紫外分光光度计UV?240(日本)。

　　1.3引物设计与合成

　　根据NCBI Genbank中人类β1?AR、β2?AR和β?actin mRNA全长序列（登录号：NM000684、NM000024和NM001101）采用Primer 3软件(http：//fodo.wi.mit.edu/cgi?bin/primer3/primer3?www．cgi)进行引物设计(表1)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物合成后用超纯水溶解，每条引物浓度均为20 μmol，等比例混合后-20 ℃ 保存备用。表1β1?AR、β2?AR、actin cDNA的引物序列（略）

　　1.4总RNA提取与cDNA合成

　　1.4.1外周血淋巴细胞分离术晨8：00~9：00抽取所选病例静脉肝素抗凝血5ml，Boyum法分离淋巴细胞（参照人淋巴细胞分离液使用说明）。1×PBS液调整细胞浓度为（5~8）×106cell/ml，经Gimsa Wright和Trypan blue染色鉴定，淋巴细胞纯度>90%，活力>98%。本过程均于采血后2 h 内完成。

　　1.4.2总RNA提取与定量Trizol法提取5×106个淋巴细胞总RNA（参照TrizolTMRNA Isolation Reagent使用说明）。1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，可见明亮的28S、18S及较淡5S三条带，无DNA污染条带；紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度，OD260/280＝1.78~2.0；所提取RNA-70 ℃ 储存备用。

　　1.4.3cDNA 的合成采用Oligo(dT)15引物，参照Reverse Transcription System说明书进行操作，所得 cDNA-20 ℃ 储存备用。

　　1.5半定量PCR检测目的基因mRNA表达50 μl的反应体系组分为：5×green Go Taq Flexi Buffer 10 μl，MgCl2(25 mmol)3 μl，dNTP 1 μl，上、下游引物（10 μmol）各0.5 μl，Go Taq DNA聚合酶(5 U/μl)0.25 μl，cDNA2 μl，双蒸去离子水补足至总体系。β1?AR、β2?AR和β?actin PCR反应条件相同：95 ℃ 预变性3 min，然后95 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s， 72 ℃ 45 s，分别进行30、35和40个循环，最后72 ℃ 延伸6 min。各取10 μl  PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定（100 V×30 min），FLUOR?S凝胶仪成像。图像经Quantity One软件各区带灰度值，公式如下：目的基因mRNA相对含量=目的基因区带灰度值内参基因区带砂度值·100%。半定量PCR重复2次。

　　1.6荧光实时定量PCR检测目的基因mRNA表达

　　1.6.1β1、β2?AR和β?actin的荧光定量PCR标准曲线的制备：采用TakaRa公司的SYBRR Premix ExTaqTM荧光定量PCR试剂盒，取一提取的cDNA样品，分别作cDNA样品原液的1/8、1/4、1/2、1和1.5倍五个cDNA含量的β1、β2?AR和β?actincDNA的PCR标准曲线，以判断荧光定量PCR的扩增效率。在12.5 μl 反应体系中，其中前三个倍比稀释浓度的cDNA样品和原液各加入1 μl，1.5倍含量的则加入原液1.5 μl，加入SYBR荧光定量PCR混合试剂6.25 μl 及上、下游引物混合液0.25 μl，最后各加灭菌超纯水补足至12.5 μl。PCR反应条件均为：94 ℃ 预变性10 s；94 ℃ 变性45 s，57 ℃ 退火45 s，72 ℃ 延伸45 s 的条件下循环45次，95 ℃ 保温1 min 后制作熔点曲线，确定扩增产物的特异性。

　　1.6.2荧光实时定量PCR分析分别测定每个样品β1、β2?AR和β?actin mRNA的Ct值，每个样品均作复孔以减少操作误差。Ct值表示每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数呈线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。采用相对定量方式表示各样品β1、β2?AR的△Ct，△Ct= Ct目的基因?Ct内参基因。再依据△△Ct=△Ct目的基因?△Ct参照因子，2-△△Ct。当目的基因与内参基因的扩增效率接近时，2-△△Ct表示所检测样品相对于作为参照因子样品的目的基因的表达倍数。

　　1.7统计学方法数据采用SPSS11.5统计软件分析处理，计量资料以x±s表示，组间差异比较用ANOVE及t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1β1和β2?AR mRNA表达半定量PCR结果琼脂糖凝胶电泳结果见图1。35和40个PCR循环组所有样品均可见一特异性条带，与预期扩增片断大小相符，无引物二聚体及非特异性条带。30个PCR循环组部分样品未见β1?ARmRNA扩增条带。Fluor?S凝胶呈像系统扫描区带灰度值，统计图见图2。3个循环组β1?AR mRNA/β2?AR mRNA比值均数两两比较均有差别（P<0.05），30个循环组检出β1和β2?AR mRNA表达差异较其他两组大，随着PCR循环次数增加，表达差异减小。

　　2.2β1和β2?AR mRNA表达荧光实时定量PCR结果见图3~7。β?actin、β1和β2?AR mRNA标准曲线图可见相关系数及扩增效率分别为0.986、91.6%；0.989、112.4%；0.973、98.0%，基本符合荧光实时定量PCR试验优化指标。扩增曲线图可见，β2?AR扩增平台期为30~40个循环，而该循环次数仍为β1?AR指数增长期。熔点曲线可见三簇波峰， β?actin、β1和β2?AR Tm值分别为89 ℃、94 ℃ 和85.5 ℃。统计分析见表2，所有样品均检出β1和β2?AR mRNA表达，不同性别组同一基因表达量无显著差别（P>0.05）。老年人外周血淋巴细胞β2?AR mRNA表达显著高于β1?mRNA （△Ct=8.10±0.73，18.61±1.69； n=30，P<0.001）。表2老年人外周血淋巴细胞β1和β2?AR mRNA表达（略）

　　3讨论　　

　　荧光实时定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时检测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。确定样品起始模板拷贝数的方法包括绝对定量及相对定量。与绝对定量不同，相对定量不关心每个样品中目的基因表达产物（mRNA）的具体拷贝数，而关注目的基因在不同的细胞类型、不同的发育周期等条件下不同的转录效率，即基因的差异化表达。就研究目的而论，该方法比绝对定量的应用范围更广泛、更符合研究的目的［4］。荧光实时定量PCR按荧光产生的原理分为染料法（SYBR Green法）及探针法。染料法的优点：(1)无需设计、合成探针，实验成本低；(2)使用方便，与常规PCR的操作几乎相同。由于SYBR Green和双链DNA是非特异性结合，反应过程中如产生非特异产物、引物二聚体将影响结果的准确性。因此，反应时要设定熔解曲线分析。“熔点曲线”基于如下原理：不同的PCR扩增片段（dsDNA）具有不同的Tm值，Tm值由扩增片断大小及碱基构成共同决定［5］。本试验中β1和β2?AR扩增片段均为209 bp，而Tm值分别为94 ℃ 和85.5 ℃，与该理论相符合。本组图7示熔点曲线均为单一波峰，并且形状锐利，表明相关基因扩增产物具有特异性。此外，实时定量 PCR技术通过2-△△Ct 方法分析相对基因表达差异［6］，必须使标准曲线中相关系数接近1、扩增效率为90%~110%［7］。本试验β?actin、β1和β2?AR mRNA相关系数及扩增效率分别为0.986、91.6%；0.989、112.4%； 0.973、98.0%，基本符合荧光实时定量PCR试验优化指标。PCR反应过程中产生的DNA拷贝数最初呈指数方式增加，随着反应循环数的增加，最终经线性期进入平台期。半定量PCR在扩增结束后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，属终点检测法，间接判断目的基因起始拷贝量，准确度较低。荧光实时定量PCR采用参数Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值可精确判断起始模板拷贝数。报道［3］，半定量PCR检测的外周血淋巴细胞β2和β1?AR mRNA丰度相近（采用40个循环）。本试验发现，荧光实时定量PCR检测β2和β1?AR mRNA表达差异显著（P<0.001），而半定量PCR检测β2?AR mRNA/β1?AR mRNA比值大小与循环次数成负相关。本组图6可见，35~40个循环为β2?AR扩增平台期，而该循环范围仍为β1?AR指数增长期，到达平台期所需的循环次数取决于样品中目的基因的起始拷贝数。结果提示，半定量PCR扩增平台期影响试验判断，而荧光实时定量PCR具有更高的准确性及灵敏度。总之，老年人外周血淋巴细胞存在β1?AR mRNA低丰度表达，不同性别组间无显著差异。本试验成功建立荧光实时定量PCR法检测β1和β2?AR mRNA基因表达，将为后续研究奠定基础。第3期荧光实时定量PCR检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2肾上腺素能受体基因mRNA表达吴坛光，等

【文献】
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