COX-2在子宫内膜癌组织中的表达及其意义

【摘要】  目的 检测环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2, COX-2）在子宫内膜癌组织中的表达,并探讨其意义。方法 利用半定量RT-PCR法检测52例子宫内膜癌组织及23例正常子宫内膜组织中COX-2的表达。结果 （1）COX-2在正常子宫内膜组织中均不表达，其在子宫内膜癌组织中的表达阳性率分别为65.4%；（2）COX-2表达量与肿瘤的分化程度有关，分化程度越低，表达量越高，高分化子宫内膜癌与低分化子宫内膜癌间差异有显著性（P<0.05）。结论 COX-2在子宫内膜癌中的表达与肿瘤的分化程度有关且高于正常组织，提示COX-2与子宫内膜癌的形成有关，且可作为判断预后及分化程度的指标。

【关键词】  子宫内膜癌；Cyclooxygenase-2；半定量RT-PCR

       【Abstract】  Objective   To investigate the expression of cyclooxygenase-2（COX-2）in endometrial carcinoma. Methods  Expression of COX-2 wasassayed by semiquantitative RT-PCR in 52 cases of endometrial carcinomaand 23 cases of normal endometrialtissues. Results  （1）The positive rate and expression quantity of COX-2 in cancer tissues were higher than in normal tissues.（2）The expression quantity of COX-2 was correlated with histological grade, the expression quantity of COX-2 was lower in well-differentiated endometrial carcinomathan in poorly differentiated endometrial carcinoma. Conclusion   COX-2 may a function importantly in tumor production and may bea good index to assess the differentiation degree and prognosis of endometrial carcinoma.

    【Key words】  endometrial carcinoma; cyclooxygenase-2;semiquantitative RT-PCR

    环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2, COX-2）是催化花生四烯酸（AA）生成前列腺素（PG）过程中重要的限速酶，参与多种肿瘤的细胞增殖、抗凋亡和血管生成，与肿瘤的发生、和预后密切相关〖1〗?

    ?狙芯恳园攵?縍T-PCR的方法检测和分析子宫内膜癌组织及正常子宫内膜组织中COX-2mRNA的表达情况,探讨其表达与子宫内膜癌的关系。

    1  材料与方法

    1.1  组织标本  收集2005年6月～2006年6月在我院及南通大学附属住院手术的52例子宫内膜癌患者手术切除的肿瘤组织,切下的标本分两份,一份立即置液氮速冻后，保存于-80℃保存备用。另一份做病理检查。患者年龄36～77岁,中位年龄为53岁,采用国际妇产科联盟（FIGO）2000年手术-病理分期标准，其中高分化腺癌19例,中分化腺癌15例,低分化腺癌18例。正常子宫内膜组织为全切除的良性子宫疾病,其中增生期内膜11例,分泌期内膜12例，年龄在32～52岁,中位年龄为41岁。

    1.2  器材  TRIZOL及DEPC购自上海华舜生物工程有限公司。RT-PCR一步法试剂盒购自晶美生物工程公司，其中逆转录酶AMV RT、Taq酶及dNTP均为FINNZYMES公司产品。凝胶电泳摄像仪为Panasonic公司产品，凝胶定量分析软件捷达801为江苏省捷达科技公司产品。

    1.3  引物设计与合成  从GenBank查取基因序列，以Primer 5软件设计COX-2及内参β-actin的引物各一对，其序列分别为，COX-2：上游5’-TTACAATGCTGACTATGGCTAC-3’，下游5’-CTGATGCGTGAAGTGCTG-3’；β-actin：上游5’-AAGTACTCCGTGTGGATCGG -3’，下游5’-ATGCTATCACCTCCCCTGTG -3’。扩增片段大小分别为238bp和495bp。上述引物均由上海生工生物技术服务有限公司合成。

    1.4  RNA样品的提取   （1）称取从-80℃冰箱中取出解冻后的子宫内膜癌组织及正常子宫内膜组织20～30mg置入匀浆器,加入1ml TRIZOL,室温下充分匀浆后倒入1.5ml离心管,静置5min;（2）加入0.2ml氯仿,振荡15s,室温静置5min;（3）4℃,12000g×15min条件下离心后,取上清液至另一1.5离心管;（4）加入0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min；（5）4℃,12000g×10min条件下离心后弃上清;（6）加入1ml 4℃预冷过的75%乙醇,轻轻洗涤沉淀, 4℃,7500g×5min,弃上清，同法再洗一遍;（7）开盖室温晾干后,加入适量DEPC水溶解（可65℃促溶15min）。如暂不做RT-PCR可先-80℃冰箱保存。

    1.5  RT-PCR实验  取DEPC处理过的0.5ml离心管，每管加入10×Reaction Buffer 5μl,50mmol/L MgCl2 1.5μl,10mmol/L的dNTP 1μl，RNA抑制剂1μl，10pmol/L的上下游引物各1μl，5u/μl的逆转录酶1μl，1u/μl的Taq酶2μl以及模板RNA 1μg,最终加DEPC水至50μl。每对引物各做两管。PCR的反应条件均相同，即各扩增管先置于55℃水浴逆转录40min后，直接置PCR扩增仪94℃变性 45s,54℃退火45s，72℃延伸60s,40个循环后，再72℃延伸5min。以不加模板的反应管作为空白对照。

    1.6  PCR产物的电泳鉴定及半定量分析  取10μ lPCR扩增产物及2μl0.2%溴酚蓝混匀后，加样于1.7%的琼脂糖凝胶，同时选一孔加标准Marker，在含有溴乙淀的TBE缓冲液中以120V电压电泳20min后观察结果。用摄像仪将含有产物条带的电泳图谱扫入电脑，以捷达801分析软件中的“凝胶分析软件”对条带进行分析，读取其积分光密度值（IOD值），以COX-2平均IOD值/β-actin平均IOD值来表示COX-2的相对表达强度。从而对COX-2的表达强度作半定量分析。

    1.7  统计学分析  运用State7.0软件对相关数据资料进行统计处理。率的比较用χ2检验，半定量数值间的两两比较采用t检验。

    2  结果

    2.1  PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果  将COX-2及内参β-actin的RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，其条带与标准Marker相比较，结果表明引物有较好的特异性，只有一条产物带，且其分子量大小与预先设计的相一致，如图1。同时从所有标本RT-PCR扩增结果看，正常子宫内膜组织中COX-2不表达。52例癌组织中，34例（65.4%）COX-2呈阳性表达，正常子宫内膜组织的表达与癌组织比，差异有非常显著性（P<0.01），如表1。

    M：DNA marker;1:正常子宫内膜；2：子宫内膜癌

    图1  正常子宫内膜及癌组织中COX-2 PCR产物电泳检测结果2.2  COX-2阳性表达者半定量结果  每份标本均以COX-2及β-actin引物做RT-PCR扩增，每对引物做两管，其半定量结果如表1，子宫内膜癌组织34例COX-2表达者其相对表达量为0.859±0.12，因正常子宫内膜组织均不表达COX-2，故相对表达量以0.00，癌组织的表达量明显高于正常胃组织（P<0.05）。表1  COX-2在子宫内膜癌及正常组织中的表达率 注：与正常子宫内膜组织比，*P<0.01

    2.3  COX-2相对表达量与子宫内膜癌分化程度的关系  见表2。高、中、低分化子宫内膜癌COX-2阳性表达例数分别为9例（47.4%）、9例（60.0%）、16例（88.9%），三种不同分化程度的子宫内膜癌中的阳性表达例数间分别做两两比较，结果低分化癌COX-2阳性率明显高于高分化癌，差异有显著性（P<0.05）。从其半定量结果看， COX-2在低分化癌的相对表达量（0.915±0.11）则要高于高分化癌的相对表达量（0.806±0.09），差异也有显著性（P<0.05）。而COX-2在高分化癌中的阳性率及相对表达量与中分化癌比，差异均无显著性（P＞0.05）。表2  COX-2相对表达量与子宫内膜癌分化 注：与高分化子宫内膜癌组比，*P<0.05

    3  讨论

    COX是由两种基因型,即COX-1和COX-2组成的催化前列腺素样物质合成的关键酶。COX-1存在于多数细胞中,主要功能是调节细胞的正常生理活性,保持内环境的稳定。而COX-2在正常组织中水平很低,一般难以检测,近来对COX-2在肿瘤发生中的意义日趋重视， COX-2在一些肿瘤组织中有高表达〖2，3〗?,与肿瘤的生长有关。肿瘤细胞分泌多种蛋白酶降解细胞外基质，是肿瘤侵袭和转移的首要步骤和分子基础，COX-2过度表达可降低介导细胞间粘附的E-钙粘蛋白活性，提高细胞与细胞外基质蛋白的粘附能力，增加肿瘤细胞的侵袭力〖4〗?。?    据报道，COX-2很少表达于增生期子宫内膜,有报道其在子宫内膜腺癌中可达69%〖5〗?。结果与本研究结果一致，本研究也发现COX-2的表达率及相对含量在子宫内膜癌中明显高于正常子宫内膜，COX-2在子宫内膜癌组织中的过度表达,与在其他上皮性肿瘤中观察到的COX-2表达从正常组织到癌前病变到癌进行性升高一致〖6〗?,提示COX-2表达上调可能在肿瘤的发生、中起重要作用，但COX-2上升的机制还不清楚。最近的研究提示可能下调EGF受体信号途径有关,并在对宫颈癌的研究中得到证实〖7〗?。此外COX-2表达与子宫内膜癌细胞的分化程度之间的关系报道较少，本研究中COX-2在不同分化程度的癌组织中的表达有差异。在高分化癌组织中,表达量少,细胞分化程度越差, COX-2表达越强,在低分化癌最强，与高分化癌差异有显著性，表明COX-2的表达与细胞的分化有关，COX-2高表达可能是分化差的标志。

    对 COX-2与子宫内膜腺癌之间关系的深入研究,将对揭示子宫内膜腺癌的发生、发展有着重要意义，同时提供了抗癌药物的靶目标,对指导子宫内膜腺癌诊断、预防及有着重要的意义。

【文献】
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