lHPLC法测定消肿止痛膏中盐酸小檗碱的含量

【摘要】  目的 建立消肿止痛膏中盐酸小檗碱的含量测定法。方法 采用HPLC法测定盐酸小檗碱的含量。色谱柱为Hypersil BDS C18（200×4.6mm ,5μm）柱；乙腈-0.033mol/L磷酸二氢钾溶液（40:60）为流动相，检测波长265nm，流速为1.0ml/min。结果 进样量在0.01845～0.3690ug范围内线性关系良好（r＝0.9995）；平均回收率为98.0%，RSD为1.36%。结论 方法操作简单，准确可靠，重现性好，可作为消肿止痛膏的质量控制方法。

【关键词】  消肿止痛膏；盐酸小檗碱；高效液相色谱法

    【Abstract】  Objective   To establish a method for the determination of berberine hydrochloride content in Xiaozhongzhitong ointment. Methods   The content of berberine hydrochloride was determined by a HPLC method with a Hypersil BDS C18（200×4.6mm ,5μm）column,  acetonitrile- 0.033mol/L potassium dihydrogen phosphate solution （40:60）as mobile phase, wavelength at 265nm and a flow rate of 1.0ml/min.Results  The linear relation was good within the range of 0.01845～0.3690g （r＝0.9995） and average recovery was 98.0%, RSD＝1.36%（n=5）. Conclusion  The method was simple, accurate, reliable and repeatable. It could be used in the quality control of Xiaozhongzhitong ointment.

    【Key words】  Xiaozhongzhitong ointment; berberine hydrochloride; HPLC

    消肿止痛膏是外用复方制剂，处方源于临床经验方，由黄柏等12味中药组成，具活血祛瘀、消肿止痛作用，用于各种外伤所致软组织损伤、骨折、脱位等病，主要表现为局部肿胀，疼痛，功能受损等症。黄柏是方中君药，具清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗伤之功效。盐酸小檗碱为其主要成分，该方法用高效液相色谱法测定其中盐酸小檗碱的含量，效果满意，可作为本品的质量控制的方法。

    1  仪器与试药

    高效液相色谱仪：Waters 高效液相色谱系统1525泵，2996型PDA检测器（美国），Empowers 工作站；消肿止痛膏试产品，批号：20060421、20060422、20060423，阴性样品小样（湖南永州市中提供）；盐酸小檗碱对照品（药品生物制品检定所）妇乐颗粒由江西南昌济生制药厂生产；盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所）；乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂为分析纯。    

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件  色谱柱：Hypersil BDS C18 （200×4.6mm ,5μm）；流动相：乙腈-0.033mol/L磷酸二氢钾溶液（40:60）［1］；检测波长：265nm；流速：1.0ml/min；柱温：室温。

    2.2   试验溶液的制备  对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷减压干燥15h盐酸小檗碱对照品18.45mg，置100ml量瓶中，加（1-100）盐酸溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取该液5ml，置100 ml量瓶中，加（1-100）盐酸溶液稀释至刻度，摇匀备用。

    供试品溶液的制备：精密称取本品0.6g，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入（1-100）盐酸溶液50ml，称定重量，加热回流60min，10℃放冷，称定重量，用（1-100）盐酸溶液补足减失重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液过微孔滤膜（0.45μm），即可。

    空白对照溶液的制备：精密称取按处方及制备工艺制备的不含黄柏的样品1.0g，按照供试品溶液制备方法制备空白对照溶液。

    精密吸取对照品溶液、供试品溶液和空白对照溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，本实验条件下检测，芍药苷的保留时间适当（5.8min），分离度为8.06，理论塔板数为6811，其他成分对芍药苷的测定无干扰，色谱图。

    2.4  精密度试验  取同一供试品溶液，连续进样5次，每次10μl，记录峰面积值， RSD＝1.63%。

    2.5  稳定性试验  取同一供试品溶液，分别于0、2、5、9、14h进样10μl，共5次，盐酸小檗碱峰面积，RSD=2.03%，表明芍药苷在14h内稳定。

    2.6  重复性试验  取同一批号的样品5份，参照2供试品溶液的制备中的方法制备样品溶液，分别取10μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，并计算盐酸小檗碱含量。结果其含量的RSD=2.05%。

    2.7  回收率试验  精密称取已知含量的同一批号的样品一定量，精密加入一定量的芍药苷对照品，按供试品溶液制备方法制备样品并测定含量，计算回收率，结果见表1。表1  回收率试验结果                               

    2.8  样品测定  取由湖南省永州市中制剂室生产的三批样品，按样品供试液制备方法制备，测定盐酸小檗碱含量，结果见表2。表2  三批样品测定结果

    3  讨论

    3.1   用二极管阵列检测器对盐酸小檗碱对照品进行200～400nm波长扫描，盐酸小檗碱229、265、和345nm有最大吸收，因此选用有较大吸收的265nm波长为检测波长。参照《药典》2005年版一部复方黄连素片［含量测定］项下的流动相进行试验，盐酸小檗碱的峰形好，分离度为8.06。因而选用乙腈和0.033mol/L磷酸二氢钾溶液配比流动相。

    3.2  由于本品为软膏剂，采用甲醇、乙醇提取，会带入脂溶性基质，分离效果不好，并影响色谱柱。本文采用酸水加热回流提取盐酸小檗碱，再10℃放置以除去脂溶性基质，盐酸小檗碱提取完全，分离效果好。

    3.3  加热回流1h与超声处理1h提取进行对照试验，结果超声提取含量偏低。同一样品取样，分别加热回流处理20、40、60、80、100min后进行测定，结果回流60min之后，测定结果无明显变化，故选择提取时间为60min。

    3.4  根据报道［2］ ，处方中黄柏的主要成分为小檗碱，因此控制其含量有重要意义。本文建立的高效液相测定法，提取方法简单，分离效果好，各项试验效果满意，可作为消肿止痛膏的质量控制方法。

【文献】
  1 国家药典委员会编.中华人民共和国药典,一部.北京：化学出版社，2005，534-535.

2 中国医学院药物研究所编.中药志（第五册）.北京：人民卫生出版社，1994，498-506.