辛伐他汀对兔急性心肌梗死后心室肌细胞L?钙离子通道电流的影响

【摘要】  目的 通过研究辛伐他汀预处理对兔急性心肌梗死后24 h心室肌细胞L?钙离子通道电流(ICa?L)的影响，探讨他汀类药物抗心律失常的细胞学离子机制。方法 45只新西兰大耳白兔随机分为3组：心梗组、辛伐他汀组和假手术对照组。采用结扎兔冠状动脉左前降支的方法建立急性心肌梗死(AMI)动物模型，采用酶解的方法分离心室肌外膜单个心室肌细胞，采用全细胞膜片钳技术记录ICa?L，同时检测各组血脂水平。结果 各组动物血脂水平无显著差异。对照组、心梗组和他汀组ICa?L电流密度峰值(0 mV)分别为(-4.56±1.01)pA/pF(n=15)，(-3.23±0.91)pA/pF(n=12)和(-4.18±0.95)pA/pF(n=12)。心梗组较对照组明显下降(P<0.05)，他汀组较心梗组明显升高(P<0.05)。另外，心梗组ICa?L失活曲线较对照组左移，他汀组较心梗组右移。结论 急性心肌梗死可导致梗死区心肌细胞ICa?L明显下降，辛伐他汀预处理可减轻ICa?L异常变化，逆转电重构，而不依赖于降血脂效应，可能为他汀类药物降低心律失常发生率的细胞学离子机制。

【关键词】  辛伐他汀 肌梗死 膜片钳 L－钙离子通道电流

    Effect of Simvastatin on L?type Calcium Current in Ventricular Myocytes from Infarcted Heart of  Normocholesterolemic Rabbits  DING Chao, LI Junxia ,CHEN Huixiao，et al．Department of Cardiology,Bethune International Peace Hospital of PLA, Shijiazhuang  050082，China

    【Abstract】  Objective  To investigate the effect of simvastatin on membrane L?type calcium current (ICa?L)  in left ventricular myocytes of rabbit heart suffering from acute myocardial infarction(AMI),so as to explore the ionic mechanism of statin for antiarrhythmia. Methods  Rabbits were infarcted by ligation of the left anterior descending coronary artery after administration of oral simvastatin  5 mg·kg-1·d-1 (Statin group) or placebo(AMI group ) for 3 days. 24 h later,single ventricular myocytes were enzymatically isolated from the epicardial zone of the infracted region.Whole cell patch clamp technique was used to record ICa?L. Results  There was not significant difference in serum cholesterol concentration among the three groups.The peak ICa?L current density(at 0 mV) was significantly decreased in AMI group (-3.23±0.91 pA/pF,n=12) compared with CON (-4.56±1.01 pA/pF,n=15, P<0.05)，while it was significantly increased in Statin group (-4.18±0.95 pA/pF,n=12)compared with AMI group(P<0.05).The steady?state inactivation curve shifted significantly in the hyperpolarizing direction in AMI group compared  with CON, while it shifted in the right direction in Statin group compared with AMI group. Conclusion  It is indicated that AMI induces significant reduction in ICa?L.The ICa?L down?regulation may underlie the altered electrical activity of the surviving ventricular myocytes. Pretreatment with simvastatin can attenuate this change without lowering the serum cholesterol level,suggesting  that simvastatin can reverse this electrical remodeling, thus contributing to the ionic mechanism of statin for antiarrhythmia.

    【Key words】  Simvastatin；Myocardial infarction；Patch clamp；L?type calcium current

    心脏猝死可由急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)诱发，是AMI最严重并发症之一，其主要原因为恶性室性心律失常，包括室速、室颤等。AMI梗死区内部及周边区尚存活的心肌细胞L?钙离子通道电流(ICa?L)明显下降，形成心肌梗死后电重构，是AMI后发生心律失常的离子机制［1］。本研究采用全细胞膜片钳技术，记录AMI后24 h兔心室肌细胞ICa?L的变化，以确定辛伐他汀预处理对兔AMI动物模型心室肌细胞电重构的逆转效应，并探讨他汀类药物抗心律失常的细胞学离子机制。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  健康新西兰大耳白兔45只，雌雄不拘，体重2～2.5 kg，购自河北医科大学实验动物中心。随机分为3组(每组15只)：急性心肌梗死模型组(心梗组)，辛伐他汀治疗组(他汀组)和假手术对照组。

    1.2  溶液与试剂  辛伐他汀(舒降之，20 mg)由默沙东公司提供。试剂成分(mmol/L)如下：①台氏液： NaCl 136.9, NaHCO3 11.9, KCl 5.4，MgCl2 0.53, NaHPO4 0.33, HEPES 5,Glucose 10，用NaOH调节pH至7.3。②KB液：KOH 70，KCl 40，KH2PO4 20，L?glutamic acid 50, Tauringe 20，EGTA 0.5, HEPES 10, Glucose 10,用KOH调节pH至7.3。③ICa?L电极外液：氯化胆碱120，CsOH 4，CaCl2 1.8，MgCl2 2，HEPES 10，Glucose 10，用CsOH调节pH至7.3。加入4?AP(5 mmol/L)、CsCl(20 mmol/L)以阻断钾电流。④ICa?L电极内液:CsCl 80，MgCl2 2，ATPNa2 5，HEPES 10，EGTA 10，用CsOH调节pH至7.3。

    1.3  血清总胆固醇测定  进行动物模型手术前，各组动物抽血进行总胆固醇测定(全自动生化分析仪)。

    1.4  AMI动物模型的建立  他汀组动物连续口服辛伐他汀(5 mg·kg-1·d-1)，心梗组和对照组同时口服安慰剂3 d。动物采用2.5%硫喷妥钠1.0 ml/kg耳缘静脉注射麻醉，利用针刺电极插入动物四肢皮下记录肢导心电图。沿左侧肋骨、胸骨交界处剪断肋骨，开胸后切开心包。分离并结扎冠状动脉左前降支，随之关闭缝合，即建立AMI动物模型。假手术对照组开胸后仅分离左冠状动脉前降支并穿线而不结扎，以排除开胸手术本身对心肌细胞电生理参数的影响。各组动物手术后单笼饲养24 h备用。

    1.5  细胞分离  采用酶解的方法分离单个心室肌细胞［2］。心梗组及他汀组细胞来源于心脏冠状动脉左前降支毗邻的左心室前壁外膜梗死区部位，特征为此梗死区外膜变为白色斑片状；对照组细胞则取自兔左心室前壁心室肌与梗死区相对应的部位。

    1.6  膜片钳全细胞记录  按Hamill法［3］进行，取上述制备好的心室肌细胞悬液数滴滴于灌流槽中，置于生物倒置显微镜(Olympus)下，静置5 min待细胞沉底附壁后，用所测电流相应的灌流液灌流，灌流速度2～3 ml/min，冲去死亡细胞碎片，选取表面光洁、横纹清晰的心肌细胞为研究对象。记录电极由硬质玻璃毛坯经水平拉制仪(Sutter P?97, USA)四步拉制而成，内充电极内液后阻抗为2～3 MΩ。采用三维液压微操纵器将电极靠近细胞进行封接，负压吸引致封接阻抗达1 GΩ以上，吸破细胞膜，补偿电容电流和电极串联电阻，形成全细胞记录模式。脉冲信号由pulse+pulsefit软件(HEKA,version 8.53),控制，通道信号经EPC?9膜片钳放大器(HEKA, 德国)放大，通过Ag?AgCl电极丝和填充电极内液的微电极导入细胞，产生的电流信号经EPC?9转换，为pulse+ pulsefit软件收集、分析。各电流幅值除以细胞膜电容所得即为电流密度，以不同钳制电压下的电流密度绘成电流?电压关系(I?V)曲线。所有实验在室温(25℃)下进行。

    1.7  统计学处理  计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析(采用SPSS 13.0)。

    2  结果

    2.1  血清总胆固醇测定  对照组、心梗组和他汀组动物血清总胆固醇水平分别为(1.75±0.55)mmol/L、(1.98±0.18)mmol/L和(1.89±0.23)mmol/L，差异无统计学意义(P>0.05)。

    2.2  辛伐他汀对心室肌细胞ICa?L I?V曲线的影响  从HP?50 mV始，阶跃+10 mV，逐步去极化到+40 mV，时程250 ms，引出ICa?L。以不同钳制电压下的ICa?L电流强度绘成I?V曲线。记录ICa?L时，HP在?50 mV，钳制电压也保持不低于?50 mV，可抑制钠通道的活性，同时使T型钙通道失活。灌流液中加入4?AP、CsCl以去除钾电流，给予无K+、Na+灌流液以进一步去除钠钾电流的干扰。电极内液中加入EGTA以螯合钙离子，减慢电流失活。电流均在细胞破膜后10～20 min之间记录，避免ICa?L的衰减(run down)现象造成误差。

    图1示3组心室肌细胞典型的ICa?L形态曲线。图2示3组细胞ICa?L的I?V曲线，均在?40 mV激活，0 mV达峰值，+50 mV时反转。心梗组与对照组相比，I?V曲线上移。他汀组与心梗组相比，I?V曲线下移，接近对照组。但ICa?L电压依赖性不变，对激活电位、峰值电位、反转电位及I?V曲线的形态轨迹均无影响。

    ICa?L电流密度峰值(0 mV)的比较显示：对照组为 (-4.56±1.01)pA/pF(n=15)，心梗组为(-3.23±0.91)pA/pF(n=12)，较对照组显著下降(P<0.05)；他汀组为(-4.18±0.95) pA/pF(n=12)，与心梗组相比，明显升高(P<0.05)。他汀组与对照组相比，无明显差异。这说明AMI可导致ICa?L明显抑制，辛伐他汀可逆转这种变化。

    2.3  辛伐他汀对心室肌细胞ICa?L失活曲线的影响  采用双脉冲刺激法，HP=-50 mV，条件脉冲为-80 mV～+40 mV，钳制时间500 ms，阶跃+10 mV，每次条件脉冲后紧跟一固定的去极化到+10 mV的测试脉冲，持续时间250 ms，将记录的ICa?L与最大激活时的ICa?L之比，与相应的条件脉冲膜电位作图得钙通道失活曲线。并通过pulse+pulsefit软件用Boltzmann方程出ICa?L半数最大失活电压(V 0.5)。图3示3组细胞的ICa?L失活曲线，心梗组与对照组相比，ICa?L失活曲线明显左移(即向超级化方向移动)，他汀组较心梗组明显右移，接近对照组。对照组V 0.5为(-16.2±4.3)mV(n=9)，心梗组为(-26.2±6.1)mV(n=8)，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。他汀组为(-21.4±5.6)mV(n=8)，与心梗组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

    3  讨论

    他汀类药物是一类3－羟基－3甲基戊二酰辅酶A(HMG?CoA)抑制剂，可通过其调脂作用明显降低心血管事件发生率。近年来，随着4S、CARE、WOSCOPS等一系列大规模随机临床试验的揭晓，显示他汀类药物不仅能降低血脂水平，而且有独立于降脂作用之外的其他有益作用，称之为他汀的多效性［4，5］，其中抗心律失常作用更是其中的热点之一。动物实验及临床研究显示他汀类药物预处理可明显降低心律失常的发生率［6，7］。所以，他汀类药物的心脏保护效应部分得益于其抗心律失常效应，但其抗心律失常效应的机制目前仍不明确。

    目前还没有他汀类药物对于心肌细胞离子通道影响的相关研究报道，本文成功建立AMI动物模型，采用膜片钳全细胞技术，研究结果表明，AMI后梗死区心室肌细胞ICa?L受到抑制，其峰值电流明显降低，可引起梗死区心室肌细胞动作电位2相时程相对缩短，该部位心肌复极相对加速，从而导致各部位心室肌复极不一致，容易形成室内折返，发生室性心律失常［1］。并且AMI后不同部位心室肌细胞ICa?L及动作电位变化的异质性，更增加了心律失常发生的几率。另外, ICa?L的下降减弱了钙离子对肌浆网的调节作用,导致细胞内钙离子的积聚,产生振荡性后电位,通过触发活动导致室性心律失常。辛伐他汀预处理可减轻AMI后离子通道的异常变化，使下降的ICa?L上调，恢复跨膜离子通道活性，逆转电重构，从而产生抗心律失常作用。

    辛伐他汀逆转AMI后细胞电重构的机制尚不明确，推测其机制可能与他汀类药物的多效性有关，包括他汀的稳定斑块、改善内皮细胞功能、抑制血小板活性、抗炎抗氧化、改善左室功能［8］、减少心肌梗死面积和无复流［9］等效应。这些作用可通过降低上游损伤，从而改变跨膜信号转导通路及离子通道的特性，影响通道蛋白的表达和合成［10］，改善心肌细胞电生理稳定性。所以我们认为，他汀的抗心律失常效应是通过心脏的整体多效性机制实现的。

    辛伐他汀预处理可以逆转电重构，而不依赖于其降血脂效应，可能为他汀类药物降低心律失常发生率的细胞学离子机制。当前抗心律失常药物主要限于直接对离子通道的阻断剂，有可能使心肌细胞离子电流出现新的不平衡，难以使复极异常得到纠正。他汀类药物以降低离子通道损伤为楔入点，没有传统抗心律失常药物可能出现的促心律失常的副作用。所以，阻断或逆转异常电重构的形成，应当成为临床治疗心律失常的一个新的重要靶点。

【】
  1 丁超，何振山，齐书英，等．兔急性心肌梗死后心室肌细胞L?钙离子通道活性的变化．心脏杂志, 2003,15(2)：109?112.

2 丁超，何振山，齐书英，等. 急性心肌梗死后2月心室肌细胞钠离子通道活性的变化. 心脏起搏与心电生理杂志，2003，17(2)：134?137．

3 Hamill OP,Marty A,Neher E,et al.Improved patch?clamp techniques for high?resolution current recording from cells and cell?free membrane patches. Pflugers Arch, 1981,391(2):85?100.

4 Lefer AM,Campbell B,Shin YK,et al.Simvastatin preserves the ischemic?reperfused myocardium in normocholesterolemic rat hearts. Circulation,1999,100(2):178?184.

5 Sotiriou CG, Cheng JW.Beneficial effects of statins in coronary artery disease?beyond lowering cholesterol. Ann Pharmacother,2000,34(12):1432?1439.

6 Chen J,Nagasawa Y,Zhu BM,et al.Pravastatin prevents arrhythmias induced by coronary artery ischemia/reperfusion in anesthetized normocholesterolemic rats. J Pharmacol Sci,2003,93(1):87?94.

7 Chiu JH, Abdelhadi RH, Chung MK,et al.Effect of statin therapy on risk of ventricular arrhythmia among patients with coronary artery disease and an implantable cardioverter?defibrillator.Am J Cardiol, 2005,95(4):490?491.

8 Ray JG,Gong Y,Sykora K,et al.Statin use and survival outcomes in elderly patients with heart failure. Arch Intern Med,2005,165(1):62?67.

9 Zhao JL,Yang YJ,Cui CJ,et al.Pretreatment with simvastatin reduces myocardial no?reflow by opening mitochondrial K(ATP) channel. Br J Pharmacol,2006,149(3):243?249.

10 Shiroshita?Takeshita A,Schram G,Lavoie J,et al.Effect of simvastatin and antioxidant vitamins on atrial fibrillation promotion by atrial?tachycardia remodeling in dogs.Circulation,2004,110(16): 2313?2319.