Cx32基因在肝癌细胞株中的表达与甲基化调节作用
【摘要】 ［目的］ 了解Cx32基因在肝癌细胞株（HepG2）中的表达及甲基化调节作用。［方法］ 采用不同药物浓度的甲基化转移酶抑制剂(5-杂氮脱氧胞苷5-Aza-CdR)分三组培养细胞株，免疫组化分析Cx32蛋白表达，甲基化特异性PCR检测Cx32基因的甲基化状态。［结果］肝癌细胞株Cx32蛋白表达减少，去甲基化后Cx32基因表达增加且定位异常，细胞生长减慢，三组细胞总阳性率分别为18.5％、77％、88％，具有显著性差异(P＜0.01)。三组细胞Cx32基因甲基特异性PCR结果分别为甲基化、部分去甲基化及完全去甲基化。［结论］肝癌细胞株（HepG2株）中Cx32表达减少，受甲基化抑制，去甲基化可增加Cx32表达。
【关键词】 肝肿瘤 连接蛋白32 甲基化
连接蛋白32（connexin32，Cx32）是正常肝脏中主要表达的连接蛋白之一，对维持肝细胞的正常功能具有重要作用，Cx32表达异常与肝癌的发生有关，是肝癌抑癌基因[1]，其下调机制不是很清楚。国外研究提示肾癌中Cx32受到甲基化抑制[2]，本文进一步研究肝癌细胞中Cx32表达下调是否与基因甲基化有关，探索增加或恢复肝细胞癌中Cx32正常表达的可能机制。
1 材料与方法
1.1 材 料
HepG2肝癌细胞株（湘雅医学院中心试验室细胞库提供）；鼠抗Cx32及二抗试剂盒（Zymed公司）；QIAamp DNA抽提试剂盒(QIAGEN公司)；5-Aza-CdR、亚硫酸氢那钠、氢醌（Sigma公司）；DNA纯化试剂盒(Promega公司)。引物参照设计如下：甲基化引物：sense 5′-GGGGCGGGTGCGGCGAT-3′、antisense 5′-CTCCGCGCCTGCGCCC-3′；非甲基化引物：sense5′-GGGGTGGGTGTGGTGAT-3′、antisense
5′-CTCCACACCTACACCCAA-3′。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，OD值均为2，扩增片段均为245bp。
1.2 研究方法
细胞培养及处理：肝癌细胞株（HepG2）采用含双抗（青霉素、链霉素100U/L）及10％胎牛血清的高糖型DMEM培养，按不同5-Aza-CdR浓度分三组（0μmol/L组、1μmol/L组、5μmol/L组），分别在25cm2培养瓶和带玻片的6孔培养板中培养，每组培养瓶5瓶、培养板5板，重复3次。取对数期生长细胞，每瓶和每孔分别接种细胞2×104、8×103。先用不含药物的培养液培养24h待细胞贴壁后弃去培养液，换用含相应药物浓度的培养液继续培养72h，每天在显微镜下观察、计数细胞（计数按血细胞计数方法）一次，重复计数结果取均值列表并进行统计分析。
细胞免疫组化：按试剂盒说明采用ABC三步法。结果判断：参照Barnes等[3]方法进行半定量评分（分A、B项）：A项，按切片中细胞显色深浅计分：0分：细胞无显色，1分：显浅黄色，2分：显黄色，3分：显棕黄色；B项，按显色细胞的比例评分：1分：1%~30％，2分：31%~75％，3分：76%~100％。两项指标结合积分：阴性（-）积分为0分；阳性（+）积分1~4分；强阳性（++）积分5~6分。每组计数5个视野，每个视野计数200个细胞。
甲基化特异性PCR：参照说明提取、亚硫酸氢钠及氢醌等修饰、提纯DNA，PCR反应体系50μl，反应条件：94℃变性2min；94℃变性30s、70℃退火1min、72℃延伸30s循环40次；72℃延伸5min。
1.3 结果判断
甲基化阳性为M阳性、U阴性；部分去甲基化为M阳性、U阳性，但OD值减弱；完全去甲基化为M阴性、U阳性。
1.4 统计学处理
采用SPSS13.0统计软件包，分别采用多因素方差（MANOVA）分析、Kruskal-Wallis H检验和Nemenyi检验，P＜0.05有统计学意义。
2 结 果
2.1 细胞培养结果
显微镜下观察细胞培养，随着5-Aza-CdR的剂量递增，细胞数增殖减慢，细胞形态变得较规则，病理性分裂减少。各组细胞计数结果取均值列表（见表1）， MANOVA分析，具有显著性差异（F=56.13，P＜0.01）。
2.2 细胞免疫组化结果
结果表明：Kruskal-Wallis H检验 H＝204.32，P＜0.01；采用Nemenyi法检验两两比较，χ21,2＝258.33，χ21,3＝391.83，χ22,3＝13.85，P值均＜0.01。表明经甲基化酶抑制剂处理后Cx32表达定位异常（主要表达于胞浆）、表达增加，各组间差异均有显著性，即2组高于1组，3组高于2组。见表2，图1~5。
2.3 甲基化检测结果
甲基化检测结果见图6。1组为甲基化（M）阳性而去甲基化（U）阴性；2组为部分甲基化阳性即甲基化（M）阳性，去甲基化（U）也为阳性但OD值减弱；3组则完全逆转，甲基化（M）阴性而去甲基化（U）阳性。
3 讨 论
Cx作为细胞间隙连接通讯（gap junctional intercellular communication，GJIC）的结构基础在多细胞生物中表达。对细胞生长、增殖、分化、维持内环境稳定等起着重要的调节作用[4]。近年大量研究显示Cx在多种肿瘤中表达减少，属于抑癌基因，与多种肿瘤包括肝细胞癌的发生、有关，但是Cx在肿瘤表达下降的机制不很清楚，国内外相关研究也不是很多。DNA甲基化通常发生在基因启动子区域CpG岛中的胞嘧啶部位形成CmpG，使基因变构，直接或间接抑制基因转录，是一种很常见的抑癌基因沉默机制，已经在多种抑癌基因中得到证实。有关Cx抑癌基因的甲基化调节目前研究不多，Cx32基因启动子富含CpG岛，已经在肾癌中证实其表达下降的原因与甲基化有关。肝细胞癌中Cx32表达减少，可能也与其基因甲基化有关，目前国内外尚未见确切报道。本文利用不同浓度的甲基化转移酶抑制剂（5-Aza-CdR）干预HepG2肝癌细胞株，结果显示未干预组，Cx32基因蛋白质表达减少，甲基化阳性，细胞生长快，病理性核分裂较多；药物干预后Cx32基因部分或完全去甲基化，基因蛋白质表达增加、定位异常，与干预剂量呈正相关，细胞生长减慢，恶性程度下降。统计学分析差异具有显著性。这一结果与国内外研究一致。表明肝癌细胞株中Cx32的表达受基因甲基化的抑制，去甲基化可以增加表达，定位异常提示还受到其他因素的调节，如翻译后磷酸化修饰、Ca2+、cAMP浓度等[5，6]都可以影响Cx32的装配和转运而导致定位异常。随着Cx32表达增加，细胞生长减慢，恶性程度下降，再次证实Cx32具有抑制肿瘤生长的作用，当然也可能5-Aza-CdR的强有效去甲基化作用，使其他抑癌基因表达增加，协同抑制肿瘤生长的结果。通过本研究，对于Cx32的调节机制、抑癌作用有了更加深入的认识，对于肝癌及其他受到Cx32抑制的恶性肿瘤的诊治提供一定的实验依据。
【】
[1] Fujimoto E, Sato H, Shirai S, et al. Connexin 32 as a tumor suppressor gene in a metastatic renal cell carcinoma cell line[J]. Oncogene, 2005, 24(22):3684-3690.
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