多西紫杉醇诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡中的氧化—抗氧化失衡研究

【摘要】  ［目的］ 探讨多西紫杉醇在诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡过程中细胞氧化应激以及氧化—抗氧化失衡情况。［方法］ 取体外培养的对数生长期SMMC-7721细胞，并将培养细胞暴露于10-8mol/L多西紫杉醇，24h后在荧光显微镜下检测细胞凋亡形态，并利用流式细胞仪测定细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)以及谷胱甘肽(glutathion，GSH)水平。［结果］ SMMC-7721细胞暴露于10-8mol/L多西紫杉醇24h后发生凋亡，细胞内活性氧为68.43%±10.47%， 显著高于对照组20.32%±3.52%(P<0.001)。细胞内GSH水平4.5±1.2 fmol/cell，显著低于对照组11.5±2.5 fmol/cell (P<0.05)。［结论］ 多西紫杉醇诱导细胞凋亡过程中存在氧化应急以及氧化—抗氧化失衡，ROS可能参与了细胞凋亡的过程。

【关键词】  多西紫杉醇 肝肿瘤 细胞凋亡 活性氧 谷胱甘肽

    多西紫杉醇是紫杉类抗癌新药，目前多用于非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌等恶性肿瘤。研究表明，多西紫杉醇对肝癌细胞有效[1,2]。本文研究了多西紫杉醇诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡作用，并且探讨了在此过程中细胞内活性氧的变化，以期从活性氧角度探讨该药的抗癌作用，为临床上应用多西紫杉醇治疗肝癌提供实验依据。

    1   材料与方法

    1.1   材   料

    本实验在山东大学药理实验室完成，实验用多西紫杉醇(商品名:泰素帝)为安万特公司产品，20mg/支。2′，7′-二氯双氢荧光素二乙酸盐（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）和二氢乙啶（dihydroethidine，HE）购自Sigma(USA)公司。谷胱甘肽（glutathion，GSH）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所第一分所。SMMC-7721肝癌细胞由中科院上海细胞生物研究所提供。

    1.2   细胞培养和处理

    SMMC-7721细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI1640(Gibco-BRL)培养液中，细胞置于37℃含5% CO2湿饱和的培养箱中培养，每3d传代一次。取对数生长期SMMC-7721细胞，并将培养的细胞随机分成实验组和对照组。24h后实验组加入含有10-8mol/L多西紫杉醇（本实验中能够完全抑制细胞生长的最低药物浓度）的RPMI1640培养液5ml，对照组加入不含任何药物的RPMI1640培养液5ml，继续培养24h后进行下列实验。

    1.3   荧光显微镜检测细胞凋亡

    取实验组和对照组细胞，用0.25%胰蛋白酶消化细胞制成单细胞悬液，PBS洗涤一次，取25μl细胞悬液加1μl吖啶橙和溴化乙啶混合液（吖啶橙 100μg/ml和溴化乙啶100μg/ml），细胞浓度1×106/ml，在荧光显微镜下（激发波长490nm）进行观察。

    1.4   细胞内活性氧检测

    取实验组和对照组细胞各6瓶，向培养液中加入DCFH-DA（终浓度5×10-6mol/L）和HE（终浓度10-5mol/L）细胞内活性氧捕获剂与细胞一起37℃孵育50min。孵育结束后收集细胞（约1×106）并悬浮于PBS，在Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪上使用氩离子激光（15mW），以随机波长488nm进行测定。绿色荧光（DCF）对应过氧化物水平通过530nm滤光片收集，而红色荧光(HE)代表超氧阴离子水平通过650nm滤光片收集。取1护细胞在BectonDic-kinson FACSCalibur流式细胞仪上检测各组荧光强度，激发光为氢离子激光波长488nm，数据采集和分析在Power Macintosh 7600/120机上用FAGS/CELLQuest软件(San Jose，CA)。实验组和对照组活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平用荧光强度±标准差来表示，两组之间比较用t检验。

    1.5   细胞内GSH含量测定

    SMMC-7721细胞传代于培养瓶，实验组用10-8mol/L多西紫杉醇作用24h，对照组未给予多西紫杉醇处理，每组重复3次。用0.25%胰蛋白酶消化细胞并吹打成单细胞悬液，1 000r/min离心5min，细胞沉淀用适量生理盐水悬浮，镜下计数。然后1 000r/min离心,细胞沉淀加0.75ml蒸馏水再加0.25ml硫代水杨酸溶解，转移至1.5ml Ependorf管，12 000r/min离心5min，取上清液检测GSH(试剂盒购自南京建成生物工程研究所第一分所)，操作按试剂盒说明书进行。SMMC-7721细胞内GSH含量用均数±标准差（x±s）表示，实验组和对照组间比较用t检验。

    2   结   果

    2.1   荧光显微镜下细胞形态改变

    SMMC-7721肺癌细胞暴露于10-8mol/L的多西紫杉醇24h，并经过吖啶橙和溴化乙啶染色后，在荧光显微镜下，活细胞呈均匀一致的绿色，细胞核明亮。早期凋亡细胞虽然也呈绿色，但是细胞核高度固缩或成片段。晚期凋亡细胞呈橙色，并有细胞膜发泡现象，细胞核明亮，高度固缩或成片段（图1）。

    2.2   活性氧水平

    使用DCFH-DA和HE对实验组和对照组细胞进行双染后，对照组荧光强度为20.32%±3.52%，实验组为68.43%±10.47%，两组间比较经过t检验P<0.01，提示实验组的活性氧水平较对照组增高。

    2.3   细胞内GSH含量

    SMMC-7721细胞暴露于多西紫杉醇之后细胞内GSH含量明显下降，经t检验有显著性差异(P<0.05，图2)。

    3   讨   论

    多西紫杉醇是继紫杉醇后又一种新型抗微管药物，与紫杉醇相比该药从细胞内外流较少且低剂量诱导细胞凋亡效应显著，近年来研究表明，多西紫杉醇诱导细胞凋亡除了诱导细胞周期阻滞以外，还存在其它机制。本文研究了多西紫杉醇诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡过程中细胞内活性氧以及抗氧化成分谷胱甘肽数量的变化，从氧化—抗氧化失衡角度探讨该药的抗癌机制。实验以DCFH-DA和HE为活性氧捕获剂，DCFH-DA捕获细胞内过氧化物，HE捕获细胞内超氧化物，用DCFH-DA和HE同时对细胞进行染色，利用流式细胞仪对细胞内活性氧进行测定，直接显示了细胞内活性氧的水平。结果证明多西紫杉醇诱导SMMC-7721肺癌细胞凋亡过程中，细胞内的活性氧水平明显增高，抗氧化成分谷胱甘肽含量下降。这提示多西紫杉醇诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡过程中存在氧化—抗氧化失衡，活性氧可能参与了这一过程。

    最近动物实验也证实增加外源性活性氧可以诱导更多的肝癌细胞凋亡，因此目前相关研究的热点是利用一些化学物质促进肿瘤细胞凋亡[3]。活性氧是真核细胞在有氧呼吸过程中，一小部分氧被完全还原生成的产物。所有的含氧自由基都是活性氧，包括超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等。这些次级产物又可进一步衍生出具有比氧更为活跃的化学物质如脂质过氧化物，并可能对机体产生损伤效应[4,5]。活性氧的化学性质、活跃程度不尽相同，其中羟自由基的化学性质最活跃，过氧化氢和超氧阴离子活性较弱，但是都可以转化成损伤能力最强的羟自由基。由于活性氧具有很强的生物活性，很容易与生物大分子反应，直接损害或者通过一系列过氧化链式反应而引起广泛的生物结构的破坏，导致细胞凋亡[6~9]。为了减少有氧代谢过程中活性氧对细胞的损害，细胞内有一系列有效的抗氧化防御系统，使得细胞内活性氧处于一个相对稳定的水平。细胞内抗氧化防御系统包括谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶等。其中GSH对于消除细胞内代谢所产生的活性氧起着关键作用，它决定着细胞对放疗和化疗的内在敏感性[10~12]。本实验研究证明SMMC-7721肝癌细胞暴露于多西紫杉醇后，细胞发生凋亡时细胞内活性氧水平升高而GSH活性下降，提示细胞受到抗癌药物作用后发生氧化应激，在这个过程中消耗了大量的GSH而导致其活性下降,而活性氧成分大量增加，导致对细胞的损伤，诱导细胞凋亡。由此我们推测多西紫杉醇作为诱导凋亡的化疗药物，具有类似去甲氧柔红霉素(Doxorubicin)和三氧化二砷的作用。

    本实验证实氧化与抗氧化失衡在多西紫杉醇诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡过程中扮演着重要的角色，提示多西紫杉醇作为化疗药物除了对肿瘤细胞的直接毒性之外，还可以引起肿瘤细胞氧化应激，导致氧化—抗氧化失衡，启动凋亡信号转导途径，最后使肿瘤细胞发生凋亡，为临床上使用多西紫杉醇肝癌提供了实验依据。

【】
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