TGFβ1抗体复合生物蛋白胶预防术后肌腱粘连

              作者：张志敏,刘建,吴尧平,孟国林,吕荣王军,王志刚 

【摘要】  　　目的：研究TGFβ1抗体复合生物蛋白胶（FG）预防鞘管区屈肌腱粘连的作用和对肌腱愈合的影响. 方法：将72只来亨鸡（leghorn）按随机化原则分为单纯TGFβ1抗体（TGFβ1 Ab）组、单纯生物蛋白胶（FG）组、TGFβ1抗体复合FG（TGFβ1 Ab＋FG）组及生理盐水(NS)组，每组各18只. 分别将鸡左足第3, 4趾趾深屈肌腱横断，作The 4?strand Cruciate repair缝合，在损伤周围注入药物. 术后5 d行早期功能锻炼，在第1，3，8 wk处死取材，分别进行大体观察、组织学检查、生物力学测试. 结果: TGFβ1 Ab复合FG组术后3，8 wk，缝合处粘连程度评分、肌腱滑动距离及模拟主动屈曲度均优于其余三组，且差异有统计学意义（P<0.05）. 四个处理组的最大抗断裂载荷差异无统计学意义（P>0.05）. 结论: TGFβ1抗体复合生物蛋白胶可以有效预防术后肌腱粘连，不影响肌腱的正常愈合进程.

【关键词】  肌腱损伤；肌腱粘连；转化生长因子β1抗体；生物蛋白胶；鸡

    【Abstract】 AIM: To study the preventing effects of the compound of transforming growth factor?β1 antibody with fibrin glue (TGFβ1 Ab+FG) against of peritendinous adhesive formation. METHODS: The long flexor tendons of the third toes in zone Ⅱ of 72 chickens (leghorn) were transversed and sutured with the 4?strand Cruciate repair technique. After operation, the chickens were divided into 4 groups. The compound mentioned above was injected around the repaired tendon in one group. TGFβ1 anti?body, FG and normal saline (NS) were used in the other 3 groups respectively. Chickens from each group were sacrificed at 1, 3 and 8 weeks after operation. The results were evaluated grossly, histologically and biomechanically. RESULTS: The gliding function of chickens, toe treated with the compound of TGFβ1 with FG was superior (P<0.05) to that treated with NS at 3, 8 weeks after operation. The gross appearance of injury site differed clearly (P<0.05) between the 2 groups. Chickens treated with TGFβ1 antibody and FG had the same effects as those treated with NS. No significant difference in tendon anastomosis breaking strength was observed among the 4 groups (P>0.05). CONCLUSION: The compound of TGFβ1 antibody with FG could significantly control the formation of fibrous adhesions without interfering the healing process.

    【Keywords】 tendon rupture； tendon adhesion； TGFβ1 antibody； fibrin glue； chicken

　　0引言

    鞘管区术后肌腱粘连是肌腱损伤后常见问题之一，是手外科尚未解决的难题之一，迄今为止，仍无有效的解决方法. 肌腱粘连是指肌腱损伤修复过程中周围组织的增生和侵入，造成肌腱运动功能障碍. TGFβ是一个Mr 25 000同源二聚体, 它通过促使成纤维细胞和巨噬细胞的募集，促进血管的生成，刺激胶原的产生，下调基质金属蛋白酶的活性和增加基质金属蛋白酶抑制剂的活性而发挥作用，是一个在急性炎症及伤口愈合中起重要作用的细胞因子［1-2］,它的过分表达可导致过度的瘢痕增生和纤维化，其中TGFβ1与胶原形成关系密切［3］. 本实验我们研究TGFβ1抗体预防肌腱粘连的可能性及对肌腱愈合后生物力学的影响. 考虑到TGF?β1抗体在局部代谢快， 作用不持久的问题， 决定将TGF?β1抗体与生物蛋白胶复合应用于局部， 旨在找到一种效果较为理想的抗粘连药.

    1材料和方法

    1．1材料TGFβ1 抗体（SC?146，200 mg/L） 购自美国Santa Cruz Biotechnology, Inc. 配制方法：在无菌条件下，将1 mL的原装抗体分成10份，每份0.1 mL（200 mg/L）. 其中5份在超净台上用经过高压蒸汽消毒的PBS液稀释成2.5 mL（每份加入2.4 mL的PBS液，8 mg/L），其余5份（200 mg/L）分别加入生物蛋白胶催化剂溶解液中，制成TGFβ1 抗体FG复合液（每份0.1 mL TGFβ1抗体+2.4 mL催化剂溶解液，8 mg/L）. 生物蛋白胶（FG  2.5 mL×2/盒）购自中外合资广州倍绣生物技术有限公司.

    1．2方法成年雄性来亨（leghorn）鸡72只（第四军医大学实验动物中心提供），体质量2.0～2.5 kg，随机分成单纯TGFβ1抗体（TGFβ1 Ab）组、单纯生物蛋白胶（FG）组、TGFβ1抗体复合生物蛋白胶（TGFβ1 Ab＋FG）组及生理盐水(NS)组，每组各18只. 浓度30 g/L戊巴比妥钠溶液肌内注射麻醉（40 mg/kg）,止血带系于大腿根部. 无菌条件下，侧方“L”形切开左足第三趾A2～A4滑车之间的鞘管，暴露并横断趾深屈肌腱. 用6?0锦纶线（上海医菱医疗器械销售有限公司）作The 4?strand Cruciate repair［4-5］缝合，7?0锦纶线作腱周缝合（peripheral tendon suture）. 然后按照分组，用1 mL无菌注射器，向鞘管区分别注入0.2 mL TGFβ1抗体（8 mg/L）和生理盐水，用生物蛋白胶专用注射器向鞘管区分别注入0.2 mL FG和TGFβ1抗体FG复合液，活动关节使药物浸没缝合口，逐层缝合皮肤. 第四趾手术方法同第三趾. 术后将左足屈曲位石膏固定，5 d后，行保护下功能锻炼（每趾40下），3 wk后拆除石膏［6］.

    术后1，3，8 wk［7］取材，第4趾标本分别行大体观察、组织学检查和缝合处粘连评分. 标准如下［6］：0级（缝合处无粘连）；I级（少量膜样、束带状粘连，局限于缝合处，肌腱滑动略受限）；II级（小块状或宽带状粘连，局限于缝合处，肌腱滑动部分受限）；Ⅲ级（较大面积紧密粘连，向缝合点远近端蔓延，肌腱滑动明显受限或几乎不能滑动）；Ⅳ级（肌腱与鞘管壁、皮下形成紧密粘连，范围广，肌腱无任何滑动）. 第3趾分别行生物力学测试［8-9］，包括肌腱滑动距离、模拟主动屈曲度及肌腱最大抗断裂载荷测定. 方法：在SHIMADZU SPL?10kN型材料实验机上,用1 N拉力牵引第三趾远端，近端借助模具连于实验机牵引部分. 逐渐增加牵引力到10 N. 记录趾深屈肌腱被牵出鞘管的位移，并且标记出掌指间关节、近侧指间关节、远侧指间关节的起始和终末的关节屈曲角度，每个标本测3次，取平均值. 再将标本制成末节趾骨-趾深屈肌腱复合体，用机器上下夹具分别夹持待测肌腱的远近端，加载速度为10 mm/min，至肌腱断裂，记录断裂载荷.

    统计学处理： 粘连评分记录值，组间比较采用H检验进行统计分析；生物力学测定值，组间比较采用方差分析法进行统计. 为减少个体间差异的影响，求出实验趾与对侧正常趾的比值，然后进行统计学处理. 用SPSS 11.5统计软件包进行数据处理， α=0.05.

    2结果

    各组手术进行顺利，止血效果良好. 术后伤口愈合良好，无感染. 有4只动物第四趾发生肌腱断裂，其中TGFβ1 Ab 组1只（3 wk），FG 组1只（3 wk），NS组1只（3 wk）. 1只动物6 wk时死亡，为TGFβ1 Ab复合FG组，均排除在统计之外.

    2．1肉眼观察术后1，3，8 wk，TGFβ1抗体复合FG组肌腱缝合处始终保持光滑，粘连程度评分多在0～2级之间（图1A～C）. TGFβ1抗体组和FG组术后1 wk，肌腱基本保持光滑，术后3 wk，肌腱缝合处形成膜性粘连，粘连程度评分多在1～2级之间，术后8 wk，缝合处形成大量粗大粘连带，充填鞘管腔，肌腱滑动受限，粘连程度评分多在2～3级之间. 而NS组术后1 wk即形成膜状粘连，术后3，8 wk，缝合处及其与皮肤之间形成大量粗大粘连带，肌腱无任何滑动，粘连程度评分多在3～4级之间（图1D，表1）.

    A: TGFβ1 Ab+FG组术后1 wk肌腱与周围组织粘连情况(×3); B: TGFβ1 Ab+FG组术后3 wk肌腱与周围组织粘连情况(×4); C: TGFβ1 Ab+FG组术后8 wk肌腱与周围组织粘连情况(×3); D: NS组术后8 wk肌腱与周围组织粘连情况(×4).表1术后3, 8 wk，各组动物肌腱粘连程度评分结果

    2．2组织学检查术后1 wk光镜下，四组肌腱未见明显差异，肌腱的桥接处开始有成纤维细胞聚集，包括腱外膜和腱内膜细胞. 但桥接处仍有间隙. 肌腱和周围组织间无明显淋巴细胞浸润（图2）. TGFβ1抗体复合FG组腱内愈合较腱周愈合早，而其余三组腱周愈合较腱内愈合早（图2A，B）. 术后3 wk光镜下，四组肌腱的桥接处均有大量成纤维细胞生长，TGFβ1抗体复合FG组成纤维细胞在数量上与其余三组未见明显差异. 术后8 wk光镜下，四组肌腱的桥接处成纤维细胞亦未见明显差异，均生长良好，部分细胞已变成长梭形，从形态上已趋于腱细胞.

    2．3生物力学测定①肌腱滑动距离: 术后3 wk及8 wk实验趾和对侧正常趾肌腱滑动距离及其比值(表2)，方差分析显示四个处理组肌腱滑动距离比值间差异均有统计学意义（F3=46.65，P3<0.05; F8=44.89，P8<0.05）.  ②模拟主动屈曲度: 此指标可以间接反映粘连程度. 术后3 wk及8 wk实验趾和对侧 正常趾肌腱滑动距离及其比值如表3，方差分析显示四个处理组肌腱滑动距离比值间差异均有统计学意义（F3=144.4，P3<0.05; F8=152.3，P8<0.05）. ③最大抗断裂载荷:此指标用于反映肌腱的最大抗拉强度. 方差分析显示术后3, 8 wk时，各处理组间最大抗断裂载荷差异均无统计学意义（F3=0.625, P3>0.05; F8=0.210, P8>0.05）. 同一处理组不同时间段最大抗断裂载荷差异有统计学意义（P<0.05,表4）.

    A：TGFβ1 Ab+FG组术后1 wk愈合情况（×10）;B：NS组术后1 wk愈合情况（×10）;C：TGFβ1 Ab+FG组术后3 wk愈合情况（×10）;D：NS组术后3 wk愈合情况（×20）;E：TGFβ1 Ab+FG组术后8 wk愈合情况（×20）；F：正常肌腱的HE染色（×10）.2术后3, 8 wk，各组动物肌腱滑动距离表3术后3, 8 wk，各组动物模拟主动屈曲度表4术后3, 8 wk，各组动物最大抗断裂载荷

    3讨论

    以往实验大多只从调控细胞增殖［10-11］或建立肌腱和周围组织间的屏障单一方面防止术后肌腱粘连［12］，本实验我们采用转化生长因子β1多克隆中和抗体复合生物蛋白胶来防止肌腱粘连，一方面直接中和腱周组织中的转化生长因子β1，阻断其在腱周局部的生物活性，减轻腱周组织成纤维细胞和巨噬细胞的募集，减少血管的生成和胶原的产生，从而抑制瘢痕的过度增生及纤维化［2］，另一方面，通过屏障作用达到防止肌腱粘连的目的. Strickland等［7］研究证实术后5～7 d是炎症反应的高峰期，这一时期抑制炎症反应，是减少瘢痕形成的最佳时期. 考虑到以往实验［11］局部注射转化生长因子β1抗体代谢快，不能发挥生物效应的问题，本实验将其与生物蛋白胶相复合，在术后5～7d生物蛋白胶吸收的同时，转化生长因子β1开始发挥生物效应，减少腱周组织瘢痕的形成，从而达到预防肌腱粘连的目的.

    本实验我们分别从形态学角度及生物力学角度对不同处理组肌腱粘连程度进行了评价，实验证实，从形态学角度，TGF?β1抗体复合生物蛋白胶（Ab+FG）组防止粘连效果明显优于其余三组，推测其防止粘连的作用机制可能有以下几点：生物蛋白胶（FG）的屏障作用，阻止了腱周组织中成纤维细胞及巨噬细胞的募集，从而减少了腱周组织胶原的形成； TGF?β1多克隆中和抗体本身的生物学效应能在炎症反应的高峰期发挥作用，进一步减少了肌腱周围组织胶原的产生；生物蛋白胶（FG）与TGF?β1多克隆中和抗体之间协同作用，互不影响，进一步减轻了损伤局部肌腱粘连的发生. 从生物力学角度，3 wk及8 wk各处理组间肌腱的最大抗断裂载荷差异无统计学意义，表明其对肌腱的愈合强度没有明显影响.

    临床上肌腱修补术后粘连一直是困扰手外科的一个难题，预防及减少粘连的方法主要是能在炎症高峰期，抑制腱周组织成纤维细胞及巨噬细胞的募集，减少腱周组织胶原的产生. 本实验我们采用TGF?β1抗体复合生物蛋白胶（Ab+FG）作用于肌腱损伤周围，一方面，可直接作用于炎性期起主要作用的炎性因子TGF?β1，另一方面克服了药物因代谢快，难在炎性高峰期发挥抗粘连作用的难题，从而可有效地防止了肌腱粘连的发生，且对肌腱的愈合强度无明显影响，为临床预防肌腱修复术后粘连问题提供了一种新的解决方法.

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