幽门螺杆菌黏唾液酸黏附素疫苗治疗小鼠幽门螺杆菌感染

                作者：杨勤,杨明刚,董洋,Ellen Xind,史俊容    

【摘要】  　　目的: 利用人类幽门螺杆菌(H.pylori)感染的小鼠模型研究唾液酸黏附素疫苗H.pylori感染的作用. 方法：把已感染H.pylori的小鼠分成4组,分别通过灌胃方法给予唾液酸黏附素100 μg加霍乱毒素CT 2 μg、单纯唾液酸黏附素100 μg、单纯CT 2 μg或PBS,1次/wk,共4次,治疗结束后4 wk处死动物,取胃粘膜行半定量细菌培养检查H.pylori情况. 结果：治疗后各组H.pylori根除率分别为: 唾液酸黏附素加CT组30%（3/10）、单纯唾液酸黏附素组、单纯CT组及PBS组根除率均为0%. 差异有统计学意义. 未根除H.pylori的小鼠，唾液酸黏附素加CT组H.pylori的定植密度明显低于其它3组（P<0.05）. 结论：唾液酸黏附素能够作为H.pylori多价治疗疫苗的组分之一.

【关键词】  幽门螺杆菌；唾液酸黏附素；克隆；免疫；疫苗

　　Immunization treatment of Helicobacter pylori infection with the vaccine composed of sialic acid adhesin and CT: An animal model study

    【Abstract】 AIM: To investigate the effects of the vaccine consisting of Helicobacter pylori (H.pylori) sialic acid adhesin and cholera toxin (CT) in the treatment of H.pylori infection in a H.pylori infected mouse model. METHODS: The C57BL/6 mice infected with H.pylori were divided into 4 groups. The mice of each group were immunized by sialic acid adhesin (100 μg) plus CT (2 μg), sialic acid adhesin (100 μg), CT (2 μg), PBS orally respectively, once a week for 4 weeks.  Four weeks after last treatment, all animals were sacrificed and stomach biopsies were collected to detect H.pylori by the semi?quantitative bacterial culture assay. RESULTS: The eradication rate of the vaccine group was 30% （3/10）. The eradication rates of the other 3 groups were all 0%. There were significant differences in the eradication rate among the vaccination group and the other 3 control groups (P<0.05). In addition, the H.pylori colonized density of vaccination group was significantly lower than that of other 3 groups (P<0.05). CONCLUSION: Sialic acid adhesin could be an effective component of H.pylori multi?valence vaccine.

    【Keywords】 Helicobacter pylori; sialic acid adhesin; cloning; immune; vaccine

　　0引言

    我们已经构建了幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H.pylori）唾液酸黏附素的高效原核表达体系［1-2］，并对其进行了纯化及功能研究［3］. 现通过建立感染H.pylori的小鼠模型观察唾液酸黏附素疫苗治疗H.pylori感染的作用，为H.pylori多价治疗性疫苗的研制奠定基础.

    1材料和方法

    1.1材料无特定病原体（specific?pathogen free， SPF） C57BL/6小鼠30只，4 wk龄，雄性，质量12~13 g，饲养条件符合2级动物要求. 纯化的重组唾液酸黏附素在以前的研究中已经制备；其余试剂为国产分析纯. H.pylori的固体培养：取冷冻保存的H.pylori菌种一环于固体培养基上连续划线接种，2h内置厌氧培养箱，37℃微需氧环境（O2 50 mL/L, CO2 100 mL/L, N2 850 mL/L）中培养72 h，湿度保持95％以上. H.pylori的菌落呈园形，凸起、光滑、灰白色、半透明，直径0.2~0.8 mm左右. 液体培养：取固体培养基上生长的H.pylori菌落至布氏肉汤中，抽滤瓶抽气换气2次以满足微需氧条件，恒温振荡培养120 r/min培养48~72 h. H.pylori的鉴定包括菌落形态、涂片观察（包括革兰氏染色观察细菌形态、暗视野观察细菌活力）、尿素酶实验. 灌胃用H.pylori的要求：革兰氏染色阴性，形态呈S形、螺旋形、杆状，暗视野下有活力，不含杂菌，密度约为1012/L.

    H.pylori感染小鼠模型的建立:采用［4］方法驯化H.pylori ss1株，分离可在小鼠胃内稳定定植的H.pylori ss1株，固体培养2~3 d，菌落经鉴定后用布氏肉汤洗下，调整细菌浓度至1012 CFU/L，每只小鼠灌胃0.5 mL（约1012/L）. 所有动物灌胃前禁食12 h，禁水4 h. 灌胃后禁食2 h. 连续5次，1 wk完成. 采用胃管法以确保H.pylori灌入胃内. 末次灌胃后4 wk随机处死5只小鼠，剖腹取胃，沿纵轴将胃切为3部分，一份行快速尿素酶试验，一份置40 g/L甲醛固定供组织学检查，一份细菌培养，检查是否感染H.pylori.

    1.2方法将已鉴定感染H.pylori的剩余的25只小鼠（共30只小鼠，鉴定用已经处死5只）随机分成4组：①疫苗组：经口喂饲唾液酸黏附素100 μg加霍乱毒素2 μg；②单纯唾液酸黏附素疫苗组：经口喂饲唾液酸黏附素100 μｇ；③单纯霍乱毒素组：经口喂饲ＣＴ 2 μｇ；④PBS组：经口喂饲PBS 200 μg/鼠/次. 治疗组10只小鼠: 后3组为对照组，每组5只小鼠. 免疫治疗前小鼠禁食12 h，禁水4 h. 每只小鼠先用30 g/L碳酸氢钠100 μL灌胃以中和胃酸，10 min后分别按上述分组灌胃，30 min后再给小鼠提供水和食物. 隔周免疫，加强免疫3次，剂量同前. 末次免疫后4 wk，禁食1 d，摘眼球放血处死动物，用750 g/L乙醇浸泡小鼠体表5 min以上. 在超净工作台内迅速取出胃用于免疫治疗后幽门螺杆菌根除的鉴定，方法采用半定量细菌培养法［5］，胃组织称重后，制成匀浆，用布氏肉汤倍比稀释后，取200 μL涂于H.pylori固体培养基，菌落计数后，单位胃组织的定植细菌密度.

    统计学处理: 采用SPSS10.0软件，计数资料用χ2检验，计量资料的比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义.

    2结果

    经尿素酶实验、组织病检查及细菌培养证实5只随机处死的小鼠全部感染H.pylori. 细菌培养发现胃组织H.pylori的定植密度为105-6/g. 胃组织培养H.pylori为阴性者定为根除，疫苗组10例中有3例根除，根除率为30%，其它3组无1例根除，根除率为0.0%. 未根除H.pylori的小鼠，我们进行了H.pylori定植密度的分析，结果发现疫苗治疗组H.pylori的定植密度为0.071×10e-6菌落形成单位/克胃组织，明显低于其它3组（单纯CT组，单纯唾液酸黏附素疫苗组和PBS组分别为7.46×10e-6菌落形成单位/克胃组织，7.5×10e-6菌落形成单位/克胃组织和7.54×10e-6菌落形成单位/克胃组织）， 其差异有统计学意义（P<0.05,图1).

    图1半定量培养法评价免疫治疗后H.pylori的定植密度

    3讨论

    H.pylori疫苗具有预防作用，同时还有治疗作用. 用重组尿素酶加上佐剂大肠杆菌不耐热毒素（LT）口服免疫已感染H.pylori的恒河猴，大多数动物胃内H.pylori定植密度减少且胃炎明显好转［6-7］；免疫治疗已成为治疗H.pylori感染最有效、最有前景的方法之一. 同时也提示单一尿素酶抗原免疫不能达到最佳的治疗效果，为了确保免疫治疗效果必须寻找其它有效抗原成分来配制更有效的多价疫苗. 在H.pylori疫苗候选成分的研制过程中，目前采用的基因重组抗原尿素酶、过氧化氢酶、细胞空泡毒素等，基本上着眼于阻断H.pylori的毒力因素，而与Hp定植密切相关的黏附素评价较少. 如从黏附素出发寻找保护性抗原也许是一种有益的尝试. 唾液酸黏附素是H.pylori近年来研究中新确定的功能蛋白，其相对分子质量约17 500，能够结合含唾液酸的鞘糖脂和胎球蛋白琼脂糖. 在其它病原微生物的研究中如诺瓦克病毒（NV），已经发现NV能够与人的唾液相结合，进一步研究表明，与NV相结合的唾液中所含的受体广泛存在于人体的消化道黏膜表面，NV通过与这些受体结合从而定植于人体，才能进一步发挥其致病作用，因此，能够与这些受体相结合的NV蛋白配体是重要的功能蛋白［8-9］. 由此，我们推测唾液酸黏附素这种新的功能蛋白也许在H.pylori致病作用中也发挥着同样重要的作用. 从它出发制备疫苗可能为H.pylori多价疫苗提供新的组分. 动物实验表明，唾液酸黏附素疫苗的H.pylori根除率为30%，即使未根除的小鼠，其H.pylori定植密度也有明显的降低（P<0.05），可用于H.pylori治疗性疫苗候选抗原. 未来的H.pylori疫苗可能是针对H.pylori自我防护因素、毒力因素、黏附因素等多种因素所构成的多价疫苗，唾液酸黏附素可能在其中发挥重要的作用.

【】
  ［1］ 白杨, Ellen X,王继德,等. 幽门螺杆菌唾液酸黏附素的克隆与高效表达［M］. 中华医学会消化病学分会第四次全国幽门螺杆菌学术会议汇编［C］. 2005:160-161.

［2］ Bennett HJ, Roberts IS. Identification of a new sialic acid?binding protein in Helicobacter pylori［J］.FEMS Immunol Med Microbiol, 2005,44(2):163-169.

［3］ 白杨, Ellen X,王继德,等.幽门螺杆菌唾液酸黏附素的纯化与功能研究［M］.中华医学会消化病学分会第四次全国幽门螺杆菌学术会议论文汇编［C］. 2005: 156.

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［6］ Bai Y, Zhang YL, Wang JD, et al.Construction of attenuated Salmonella typhimurium Strain expressing Helicobacter pylori conservative region of adhesin antigen and its immunogenicity［J］.World J Gastroenterol, 2004,10(17):2498-2502.

［7］ Bai Y, Li LR, Wang JD, et al.Expression of Helicobacter pylori Hsp60 protein and its immunogenicity［J］.World J Gastroenterol, 2003,9(12):2711-2714.

［8］ Tan M, Jiang X.Norovirus and its histo?blood group antigen receptors: an answer to a historical puzzle［J］.Trends Microbiol, 2005,13(6):285-293.

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