肿瘤坏死因子β基因多态性与乙肝后肝纤维化的相关性研究

             作者：依沙兰,陈红,邓永东,赵正斌

【摘要】  　　目的：研究甘肃地区汉族人群TNF?β基因多态性与乙肝后肝纤维化的相关性. 方法：提取146例乙肝后肝纤维化患者和138名健康人基因组DNA，应用套式PCR和AS?PCR对TNF?β?804位基因多态性进行分析，同时检测肝纤维化指标，比较其与基因型的关系. 结果：①乙肝后肝纤维化组AA基因型频率和A等位基因频率均高于健康对照组，其差异有统计学意义(P<0.05). ②除AA基因型IV.C外，不同TNF?β基因型间肝纤维化指标的差异均无统计学意义(P>0.05). 结论：TNF?β?804位点基因多态性与乙肝后肝纤维化相关，804A等位基因可能是乙肝后肝纤维化发生的易感因素.　

【关键词】  肝炎，乙型；肝硬化；肿瘤坏死因子?β；基因多态性

    【Abstract】 AIM: To investigate the relationship between the tumor necrosis factor beta (TNF?β) gene polymorphism and HBV?induced liver fibrosis in Gansu province in China. METHODS: A case control research was done on 146 HBV?induced liver fibrosis patients and 138 healthy individuals as a control group. DNA was extracted from peripheral blood leukocytes by DNA extraction kit. TNF?β gene polymorphism was studied by  nested PCR and allele specific PCR (AS?PCR) techniques. Simultaneously fibrotic markers were detected and compared among different genotypes.  RESULTS: The frequencies of the TNF?β AA genotype and A allele increased significantly in HBV?induced liver fibrosis patients as compared with healthy controls (P<0.05). Except AA genotype IV.C, the fibrotic markers among the different TNF?β genotypes had no statistical dif?ference (P>0.05). CONCLUSION:  Polymorphism in TNF?β gene intron +804 is associated with HBV?induced liver fibrosis. The allele A might confer risk for the development of HBV?induced liver fibrosis.

    【Keywords】 HBV; liver cirrhosis; tumor necrosis factor?β; gene polymorphism

　　0引言

    肝纤维化是各种肝病向肝硬化的必经阶段,也是可以逆转的阶段，尤以乙肝后肝纤维化最多见. 肝纤维化的形成是一缓慢而复杂的过程,不论何种致病因素,其机制都是肝脏受到外界刺激后引起细胞因子的释放,细胞因子?细胞?细胞外基质相互作用,最终使基质沉积于肝脏［1］. 肿瘤坏死因子?β(tumor necrosis factor?β, TNF?β)是一种致炎因子,在炎症反应和免疫调节中起着重要作用. 由于TNF?β的重要生物学作用及其基因的特殊位置,有必要研究乙肝后肝纤维化患者TNF?β基因多态性对肝纤维化水平的影响. 因此，本文应用套式PCR(nested PCR)和等位基因特异性PCR(allele?specific PCR,AS?PCR)法探讨甘肃地区汉族人群TNF?β基因多态性与乙肝后肝纤维化患者的相关性.

    1对象和方法

    1.1对象2005?08/2006?07兰州大学第一感染科住院的乙肝后肝纤维化患者共146例，诊断符合中华医学会肝脏病学会制定的肝纤维化标准［2］. 男性107例，女性39例，年龄17～81（48.0±13.7）岁；经病理组织确诊20例，经B超诊断126例. 138例正常对照来自健康体检人群，男性92例，女性46例，年龄20～75（46.5±14.6）岁. 以上两组均为汉族，且无血缘关系，具有可比性.

    1.2方法

    1.2.1基因组DNA的提取从3 mL EDTA?Na2抗凝外周血提取有核细胞，采用上海生工生物工程有限公司的DAN提取试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存备用.

    1.2.2引物设计与合成参照有关［3］设计一对外引物，P1: 5′?AGAGCTGGTGGGGACATGT CTG?3′，P2: 5′?CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA?3′，扩增包含804位点的基因片段；针对TNF?β?804位点的等位基因分别设计两条特异性引物，P3: 5′?GAGGTGAGCAGCAGGTTTGAGGG?3′，P4: 5′?GAGGTGAGCAGCAGGTTTGAGGT?3′，两者仅3′端的末端碱基不同，分别对应于804位点的两个等位基因(C/A)，两者分别与P2配对，构成两套内引物. 引物由上海生工生物工程有限公司合成.

    1.2.3套式PCR和AS?PCR法基因分型第一步扩增：分别以患者和健康者的基因组DNA为模板，使用外引物P1, P2进行第一步扩增，扩增体系25 μL：1 ng引物P1, P2，0.2 mmol/L dNTP，16.67 nkat Taq DNA聚合酶，50 ng模板DNA，10×PCR缓冲液，2 mmol/L MgCl2. 扩增条件：95℃预变性5 min，按以下条件循环32次，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，末次循环后，72℃再延伸7 min. 第二步扩增：以第一步扩增产物为模板，使用内引物P3, P4并采用AS?PCR技术进行第二步扩增，扩增体系25 μL：1 ng等位基因特异性引物P2, P3(或P4)，0.2 mmol/L dNTP，16.67 nkat Taq DNA聚合酶，2 μL首轮扩增的产物，10×PCR缓冲液，2 mmol/L MgCl2. 扩增条件：95℃预变性5 min，按以下条件循环30次，95℃变性45 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，末次循环后，72℃再延伸7 min.

    1.2.5血清肝纤维化指标的测定血清透明质酸（HA），层黏蛋白（LN），Ⅲ型前胶原（HpcⅢ），IV型胶原（IV.C）采用放射免疫法测定，由本院放射免疫检测室专人操作.

    统计学处理: 采用直接计数法等位基因频率和基因型频率，研究对象的Hardy?Weinberg平衡检验以及组间比较均采用χ2检验；乙肝后肝纤维化患者的TNF?β各基因型血清肝纤维化指标间比较用单因素方差分析及两两比较. 所有数据统计均由SPSS10.0统计软件完成.

    2结果

    2.1TNFβ基因型检测结果取8 μL PCR扩增产物，经含溴化乙锭的20 g/L琼脂糖凝胶电泳，电泳结果经凝胶成像及分析系统拍照，TNF?β?804位点等位基因片段用外引物P1, P2经PCR扩增得到约740 bp大小的片段（图1），与预期结果一致.

    扩增产物片段用内引物P2和P3/P4经PCR二次扩增，产生3种不同的电泳条带(即不同的基因型)(图2)，若仅在使用特异性引物P3(或P4)时扩增出694 bp的条带，则为CC型(或AA型)纯合子，如果两份AS?PCR均扩增出694 bp的条带，则为CA型杂合子. 采用单纯随机抽样法对其中部分样本进行重复基因型检测，结果一致.

    2.2乙肝后肝纤维化组与对照组TNF?β基因型及等位基因频率患者组与正常对照组TNF?β等位基因频率及基因型的分布应用Hardy ?Weinberg定律进行检验,两个群体都达到了遗传平衡(P>0.05). 患者组与健康对照组基因型频率比较差异有统计学意义(χ2=7.572，P<0.05)，AA型频率高于对照组；患者组与对照组C, A等位基因频率比较差异也有统计学意义(χ2=7.545, P<0.05),A等位基因频率高于对照组(表1).表1乙肝后肝纤维化组和健康对照组TNF?β基因型及等位基因的分布和频

    2.3TNF?β基因多态性与乙肝后肝纤维化指标对乙肝后肝纤维化患者的TNF?β三组不同基因型和其肝纤维化指标进行单因素方差分析(表2). 146例患者只有AA基因型IV.C与其他两个基因型差异有统计学意义(P<0.05)，其余肝纤维化指标在不同TNF?β基因型间的差异均无统计学意义（P>0.05）.表2乙肝后肝纤维化患者TNF?β基因型与患者血清肝纤维化指标

    3讨论

    目前,已知肿瘤坏死因子(TNF)分为两种TNF?α和TNF?β. TNF?β是由淋巴细胞在抗原或有丝分裂原刺激下所产生的一种淋巴因子，具有复杂的生物学活性，广泛参与免疫系统的发育及免疫反应（特别是细胞免疫）的调节. 至今为止，国内外对TNF?β与疾病的关联研究比较少，少数的研究集中在脓毒血症等感染性疾病［4］，以及重症肌无力［5］等自身免疫性疾病，并有研究表明TNF?β在系统性红斑狼疮［6］,IgA肾病［7］等疾病中起一定作用. TNF?β基因位于第六号染色体6p21(MHC类基因区内),全长约为3kb,由4个外显子和3个内含子组成,在第三外显子区域内804位点处存在1个C→A突变的单核苷酸多态性(SNP),并进一步导致26N替换,可能由此影响其表达水平及生物学活性.

    TNF?β与TNF?α在基因和蛋白分子结构以及生物学功能上都有许多相似之处，两者氨基酸约28%相同，且作用于同一细胞膜受体. 有研究表明，TNF?α可诱导肝细胞合成大量细胞因子，促进慢性炎症持续存在并导致肝纤维化的形成. 表明TNF?α在肝脏炎症反应和纤维化的启动中起重要作用［8］. 国内学者林菊生［9］等报道TNF?α基因多态性与乙肝性肝纤维化及肝硬化有一定的相关性. 因此，我们推测TNF?β基因多态性可能与乙肝后肝纤维化的发生有一定的关联.

    我们检测了甘肃汉族人群中146例乙肝后肝纤维化患者和138例健康人群TNF?β?804位点的基因多态性. 结果表明，患者组和对照组TNF?β?804位点基因型比较,差异有显著性(P<0.05)，肝纤维化组AA型频率明显高于对照组；两组的C, A等位基因频率比较,差异也有显著性(P<0.05)，肝纤维化组TNF?βA等位基因频率比对照组显著增高；提示TNF?βA等位基因可能是乙肝后肝纤维化的易感基因. 基于TNF?β?804位点的基因多态性与乙肝后肝纤维化的相关性,我们进一步研究了其与肝纤维化指标间的相关性,结果显示，只有AA基因型IV.C与其他两个基因型有显著性差异(P<0.05)，其余肝纤维化指标在不同TNF?β基因型间的差异均无统计学意义（P>0.05）；提示TNF?βAA基因型可能促进IV.C的生成，从而促进肝炎向肝纤维化的. 有资料显示，单一的血清标志物判断肝纤维化的符合率较低，需多选择几种进行综合分析，其中以HA, LN和HpcⅢ效果较好,IV.C不是最敏感的肝纤维化标志物［10］. 因此，我们认为TNF?βAA基因型促进IV.C的生成导致肝脏纤维化可能是一个辅助因素，至于什么是导致肝脏纤维化的主要因素还有待于进一步研究.

    乙肝后肝纤维化是一种由遗传、机体免疫和环境因素共同作用所致的复杂的感染性疾病，关于TNF?β基因多态性在肝纤维化的发生、发展中的作用以及患者对的反应及患者的预后与TNF?β基因多态性的关系还必须进一步的研究,从而为预防肝纤维化发展为肝硬化提供有利依据.

【】
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