产紫杉醇菌种改良方法的研究
作者：姚清国 段书德 张星辰 冯俊霞、
【关键词】 紫杉醇； 真菌发酵； 菌种改良
紫杉醇（taxol）是一种具有抗癌活性的四环二萜类化合物，最早从短叶红豆杉中分离得到［1］。紫杉醇能与细胞微管结合而抑制肿瘤细胞的分裂 ［2］ ，在临床上用于乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜癌、子宫癌等多种人体恶性肿瘤。当前紫杉醇全部从红豆杉的树皮提取得到，由于树皮中紫杉醇含量极低（约0.02%），且红豆杉树林分布较少，生长缓慢，造成该药物供不应求，价格昂贵。化学合成步骤繁琐，产物复杂［3］。利用真菌发酵合成紫杉醇是一个颇有前景的方法，1993年首次从短叶红豆杉的韧皮部中分离到一种能发酵合成紫杉醇的内生真菌［4］，目前已经从红豆杉中分离了至少200多种紫杉醇产生菌［5］。利用此类真菌可在一定的培养基上生长产生紫杉醇及相关化合物。但是目前分离的紫杉醇产生菌发酵液中紫杉醇的含量低，未能达到化水平，迫切需要对其进行菌种改良。
1 通过诱变改良菌种
通过外界诱变得到高产菌株是提高发酵效率的重要途径，外界的高能量射线和诱变剂可以使细胞的遗传物质发生改变，优化基因结构，使细胞的代谢途径发生改变，可培育出稳定遗传的高产菌株。国内周东坡等［6］从东北红豆杉中分离得到紫杉醇产生菌，该野生菌株产紫杉醇的量比较低(125.1 μg/L)，经过紫外线、EMS、60Co 、NTG等诱变剂诱变得到高产突变株，其紫杉醇产量达到314.1 μg/L，远远高于野生菌株紫杉醇的产量［7］。除此之外还可以对真菌的原生质体进行诱变改良，赵凯等［8］制备了紫杉醇产生菌树状多节孢原生质体，同时对紫杉醇产生菌原生质体进行了紫外线和氯化锂复合诱变，经筛选获得一株遗传性稳定的紫杉醇高产菌株，其紫杉醇产量提高到418 μg /L。最近报道周东坡教授领导的课题组通过8年的努力工作，己成功得到一株紫杉醇高产真菌，又经物理、化学、原子能、卫星搭载等多种方法并多次诱变己培育一株高产紫杉醇菌株，发酵时紫杉醇产量达448.5 ug/l［9］。可见通过外界因素诱变高产紫杉醇菌株然后筛选高产菌株，可以大大提高紫杉醇的产量，虽然筛选过程比较繁琐，需要大量人力、物力，但此种途径仍有希望使紫杉醇发酵生产走向工业化。
2 利用原生质体融合改良菌种
原生质体融合技术是一项发展迅速的生物学技术，此项技术能把亲缘关系比较远的植物体细胞融合在一起，可使细胞实现远缘杂交，扩大了遗传物质的重组范围，是改造细胞遗传物质的有力手段［10］。原生质体融合技术在微生物遗传育种中也发挥着重要的作用，微生物细胞原生质体膜易于融合，没有极性，相互融合的是整个胞质与细胞核，保持了遗传物质传递的完整性，易于得到杂种。该技术不受双亲细胞亲缘关系的影响，操作方便，遗传信息转移量大，近几年也广泛应用于微生物菌种改良中［11，12］。双亲灭活原生质体融合是对原生质体融合技术的重大改进，可以在不利用选择培养基的情况下，排除双方亲本类型，有利于选择重组融合子，提高筛选效率［13］。最近有人采用双亲灭活原生质体融合的实验进一步提高了紫杉醇产生菌的产量，使紫杉醇的发酵产量达到468.162 μg/L［9］。可见除常规诱变外，采用原生质体融合技术也能够大幅度提高紫杉醇产生菌的产量。
3 利用基因工程技术改良菌种
基因工程是在体外将不同来源的DNA进行剪切和重组，然后将之导入宿主细胞，使其扩增表达，从而使宿主细胞获得新的遗传特性，形成新的基因表达产物。利用基因工程技术改造和更新紫杉醇在微生物中的合成途径，以提高紫杉醇的产量是今后研究的重要方向。其中利用双牛基焦磷酸为前体物合成紫杉醇需要约20个酶促反应。因此可以分离或合成关键酶的基因，利用基因工程技术使该基因在菌体中超表达，从而加快合成紫杉醇反应的进行。Huang等［14］将异戊二烯焦磷酸异构酶、双牛基焦磷酸合成酶与紫杉二烯合成酶的基因转化大肠杆菌进行原核表达，通过融合5-磷酸1-脱氧木酮糖DXP合成酶基因提高这些酶的表达量，获得紫杉醇生物合成的重要中间产物紫杉二烯，产量达1.3 mg/L，成为基因工程菌合成紫杉醇中间体的先例。目前，通过基因工程途径提高紫杉醇产生菌的产量的研究进展较慢，原因是微生物中紫杉醇生物合成途径不十分清楚，紫杉醇合成调节的方式和关键酶基因表达的调控十分复杂［15］，随着紫杉醇合成途径研究的深入，利用基因工程技术有望大幅度提高紫杉醇产生菌合成紫杉醇的产量。
目前研究结果表明, 虽然通过各种手段改良菌种，提高紫杉醇产生菌的产量，但紫杉醇真菌发酵液中紫杉醇的含量仍然很低，要进行工业化生产，至少要达到毫克级水平［16］。对紫杉醇高产菌株进行筛选以提高发酵液中紫杉醇含量是今后研究工作的重心。随着对紫杉醇生物合成途径了解的逐渐深入，利用基因工程手段，对能够产紫杉醇的内生真菌进行遗传改造，构建紫杉醇高产量工程菌株, 是紫杉醇实现微生物发酵法工业生产的必然途径，有望解决迫在眉睫的紫杉醇药源问题，改善目前市场上紫杉醇供不应求、价格昂贵的现状，又可保护濒临灭绝的珍稀红豆杉树种。
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