Cx43对大鼠急性水中毒后脑水肿的影响

【摘要】  目的: 探讨缝隙连接蛋白43(Cx43) 对大鼠急性水中毒后脑水肿的影响. 方法: 术前2 h于右脑室注射Cx43阻断剂反义寡核苷酸（ODNs)或生理盐水，大鼠脑水肿由急性水中毒后引起，用抗－胶质原纤维酸性蛋白 (GFAP)免疫组织化学标记法观察脑皮质星形胶质细胞形态、数量的变化；用比重梯度法测定脑组织比重. 结果: 急性水中毒后脑水肿生理盐水对照组脑皮质区GFAP阳性细胞较ODNs 预处理组多（P<0.05）,细胞胞体较肥大；生理盐水对照组脑组织比重较ODNs处理组降低明显（P<0.05）. 结论: 阻断Cx43可减轻大鼠急性水中毒后脑水肿的程度，Cx43可能参与了脑水肿的形成.

【关键词】  脑水肿 星形胶质细胞 缝隙连接蛋白43

　　0引言

　　脑水肿是神经科危重患者常见的一种病变,也是脑血管病、颅内占位性病变、颅脑损伤和炎症等过程的主要病理生理改变. 超微结构显示,在脑水肿早期主要表现为星形胶质细胞肿胀,它可能是脑水肿发生过程中的一个重要因素［1］. 而对星形胶质细胞膜上主要表达的Cx43是否参与脑水肿形成的研究很少. 我们初步探讨了Cx43与水中毒后脑水肿的相关性.

　　1材料和方法

　　1.1材料健康清洁级SD大鼠48只，体质量230～250 g(第四军医大学实验动物中心)；小鼠抗GFAP抗体、兔抗鼠IgG稀释液、生物素?卵白素?过氧化物酶复合物ABC, DAB（美国 Sigma公司）；溴苯（天津市福晨化学制品厂）；煤油( 西安化学试剂厂)；反义寡核苷酸序列: 5′?ACTCCAGTCACCCAT3′(上海生工合成).

　　1.2方法

　　1.2.1实验分组将大鼠随机分为Cx43阻断剂预处理组和生理盐水对照组. 急性水中毒后两组将存活大鼠按脑水肿后处死时间点随机分为 20，30，60 min 3个亚组；每亚组8只，其中5只用做免疫组化，3只用于测脑组织比重.

　　1.2.2动物模型制作参照［2-3］的方法制作大鼠急性水中毒后脑水肿模型，血脑屏障无受损，即向大鼠腹腔快速注射相当于大鼠体质量20％的蒸馏水和去氨基精加压素（DDAVP，0.4 μg/kg）.

　　1.2.3侧脑室注射Cx43阻断剂反义寡核苷酸用生理盐水稀释至1.5 mmol/L,大鼠右侧脑室为注射靶点(前囟向后0.90 mm,右侧旁开中线1.3 mm,硬膜下4.2 mm), 在脑水肿前2 h用微量注射器缓慢注入2 μL反义寡聚核苷酸或等体积生理盐水.

　　1.2.4组织制备以20 mL/L戊巴比妥钠按40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，经升主动脉插管，生理盐水冲洗后灌注40 g/L多聚甲醛500 mL，取脑后浸入40 g/L多聚甲醛，持续4～6 h. 置于2 g/L蔗糖溶液至沉底，冰冻切片机冠状位连续切片，片厚10 μm，贴附于载玻片上. 每鼠取5张切片行免疫组化染色.

　　1.2.5免疫组织化学ABC法染色切片入PBS液充分漂洗后,入3 mL/L Triton X?100处理,依次孵育:小鼠抗?GFAP(1∶3000) 抗体稀释液24 h(4℃)；生物素标记的兔抗鼠IgG (1∶500) 稀释液2 h(室温)；ABC复合物(1∶500) 2 h (室温). 每一步骤后均用PBS液漂洗3次,每次10 min,最后DAB/H2O2溶液呈色20 min(室温). 室温常规裱片、脱水、透明、DPX封固、光镜观察. 阴性对照用PBS替代一抗,其余步骤同上. 光镜观察结果.

　　1.2.6脑组织比重的测定参照文献［4］的方法制作脑组织比重梯度柱测定脑水肿后脑组织比重的变化. 用溴苯(比重1.4930)和煤油(比重0.7720)两种有机溶液配制成备用液A(比重0.9750)和备用液B(比重1.0650 ). 各取备用液A和B 100 mL引流至量筒内，静止30 min，用微量注射器分别吸取由无水硫酸钠配制的系列标准液(比重分别为1.0240, 1.0320, 1.0400, 1.0560) 滴入梯度柱，待下沉 2 min后立刻准确读取量筒上的刻度. 以下沉刻度为横坐标，标准液比重为纵坐标求出标准曲线回归方程. 梯度柱的测量范围在1.0200～1.0650 之间. 6组动物在水中毒后各时间点迅速断头取脑，在大脑皮层采取直径1.2 mm,厚度为2 mm的5个样本. 放入梯度柱内. 待下沉2 min时记录下沉刻度,根据标准曲线回归方程求出脑组织比重.

　　1.2.7图像分析在免疫组化切片紧靠损伤区周边皮质区用荧光显微镜随机取5个视野计数GFAP免疫反应阳性细胞，取均数作为此切片该区域的得数，并观察细胞形态. 计数用Image Pro?Plus 5.1软件，由病理医师盲法执行.

　　统计学处理：用SPSS 11.0软件对数据进行统计处理，计量资料以x±s表示. 多样本间均数比较采用One?Way ANOVA检验，组间比较采用Donnett?t检验，P<0.05为差异有显著性.

　　2结果

　　2.1免疫组化染色急性水中毒后20 min生理盐水对照组和ODNs预处理组GFAP阳性星形细胞肿胀不明显；30 min时细胞逐渐肿胀，细胞数量逐渐增多；60 min时细胞胞体明显肿胀，细胞个数明显增多；但两组大鼠在急性水中毒后各时间点二亚组间相比，生理盐水对照组细胞肿胀明显，胞体肥大深染，突起粗大；生理盐水较对照组细胞个数增多明显；两组相比有显著差异(P<0.05，图1，表1).

　　A～C： 生理盐水对照组急性水中毒后20,30,60 min； D～F： ODNs预处理组急性水中毒后20,30,60 min. 标尺=50 μm.

　　图1各时间点脑水肿生理盐水对照组与ODNs预处理组大鼠脑皮质区GFAP免疫阳性细胞DAB ×20（略）

　　表1各时间点对照组与ODNs预处理组大鼠脑皮质区GFAP阳性细胞数（略）

　　aP<0.05 vs 生理盐水对照.

　　2.2液体比重柱的稳定性和梯度均匀性共制作了5个比重梯度柱，反映比重柱高度与比重直线相关性的指标?决定系数(coefficientof determination, r2 ) 均≥0.998. 表明制作的液体比重柱的稳定性和梯度均匀性均较佳.

　　2.3脑组织比重急性水中毒 20，30，60 min后，随时间延长，两组大鼠脑皮质区脑组织比重均逐渐降低，说明脑组织含水量逐渐增多；但在急性水中毒后各时间点两亚组比较，生理盐水对照组脑组织比重较ODNs 预组降低明显（P<0.05，表2）.

　　表2各时间点脑水肿对照组与ODNs预处理组大鼠脑皮质区组织比重（略）

　　aP<0.05 vs 生理盐水对照.

　　3讨论
 
　　缝隙连接蛋白(connexins,Cx)是一个蛋白超家族,目前在哺乳动物中发现的Cx至少有20种［5］,在哺乳动物脑内,星形胶质细胞上主要表达Cx43. 6个结构相同的Cx在细胞膜上形成六聚体结构构成缝隙连接半通道［6］，相邻两个细胞各自胞膜上的缝隙连接半通道对接而成缝隙连接(GJ). 星形胶质细胞间及星形胶质细胞和神经元、其它胶质细胞间存在广泛的GJ［7］，使细胞间进行信息、能量和物质的交换，参与细胞间物质交换的代谢偶联和电信号传递的电偶联，对细胞的新陈代谢、内环境稳定等生理过程起着重要的调控作用.
星形胶质细胞上表达的水通道蛋白4（AQP4）主要参与水的转运，在形态上已有报道AQP4与Cx43形成的缝隙连接成正四面体分布［8-9］，提示Cx43与AQP4在功能上具有相关性,共同维持着渗透平衡. 袁华等［10］报道星形胶质细胞对周围环境渗透压的变化比神经元敏感，并可能通过GJ主动调节神经元对渗透压的反应. 曹荣等［11］通过体外实验说明星形胶质细胞可通过Cx43半通道参与细胞渗透压的调节. 在细胞毒性脑水肿中，Na+, Cl-大量储存于细胞内, 水分进入细胞内以恢复平衡,造成过量的Na+, K+和水在细胞内积聚而致脑水肿，K+和水的平衡密切相关［11］. 脑损伤后细胞外K+浓度明显升高，星形胶质细胞摄入过多的K+可迅速通过GJ运送到相邻的细胞，加重脑水肿并使脑水肿范围扩大.

　　我们采用大鼠急性水中毒后脑水肿模型（血脑屏障未受损），观察Cx43脑水肿相关性发现：生理盐水对照组脑皮质GFAP阳性细胞比ODNs预处理组细胞肿胀明显，细胞增生数量较多；生理盐水对照组脑皮质区组织比重较ODNs预处理组降低明显. 说明生理盐水对照组大鼠脑水肿较ODNs 预处理组明显. 实验通过减少Cx43表达，进而减少了GJ的形成，阻止K+在细胞间的传导，一定程度上减轻了脑水肿程度. 推测Cx43可能参与脑水肿的病理形成过程.

【文献】
  　　［1］ 张新宇,孙晓川. 星形胶质细胞与脑水肿［J］. 创伤外科杂志,2008,10(1):85-87.

　　［2］ Weed LH, McKibben PS. Experimental alteration of brain bulk［J］. Physiologly,1999,48:531-558.

　　［3］ Gullans SR, Verbalis JG. Control of brain volume during hypoosmolar andhypoosmolar conditions［J］. Annu Rev Med,1993,44:289-301.

　　［4］ Marmarou A, Poll W, et al. A simple gravimetric technique for measurement of cerebral edema［J］. Neurosurg eng,1978,49:530-537.

　　［5］ Lian Y, Day KH, Damon DN, et al. Endothelial cell?specific knockout of connexin 43 causes hypotention bradycardiain mice［J］. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(17):9989-9994.

　　［6］ Duval N, Gomès D, Calaora V, et al. Cell coupling and Cx43 expression in embryonic mouse neural progenitor cells［J］. J Cell Sci,2002,115(16):3241-3251.

　　［7］ Bezzi P, Volterra A. A neuron?glia signalling network in the active brain［J］. Curr Opin Neurobiol, 2001,11(3):387-394.

　　［8］ Saez JC, Berthoud VM, Branes MC, et al. Plasma membrane channels formed by connexins: their regulation and functions［J］. Physiol Rev,2003,83:1359-1400.

　　［9］ Rash JE, Yasumura T. Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin?4 in freeze?fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis［J］. Cell Tissue Res,1999,296(2):307-321.

　　［10］ 袁华,段丽,邱建勇,等. 大鼠侧脑室注射甘珀酸后下丘脑视上核星形细胞和神经元对高渗刺激反应的影响［J］. 解剖学报,2004,32(2):127-131.

　　［11］ 曹荣,兰莉. 渗透压变化对缝隙连接蛋白在培养的大鼠下丘脑星形胶质细胞和神经元表达的影响［J］. 解剖学报,2006,37(4):371-375.