HIFU消融脾脏治疗脾功能亢进的动物实验研究

              作者：梅浙川, 刘永军, 廖元江, 李发琪

【摘要】  目的：探讨高强度聚焦超声（HIFU）消融脾脏脾功能亢进的可行性和有效性. 方法： 15只健康成年杂种犬随机分为对照组（A）、脾静脉结扎（SVL）组（B）和SVL+HIFU治疗组（C）. SVL术后3 wk对C组犬开腹行HIFU脾脏消融. 观察3组犬外周血像、脾脏体积、消融后并发症及脾脏病变化. 结果：结扎脾静脉主干及主要分支，可形成犬淤血性脾肿大、脾亢. HIFU消融区域可见凝固性坏死，血管闭塞，血栓形成. 坏死能逐渐吸收、纤维化或包裹机化. 无脾脓肿、脾破裂等并发症出现. 消融后脾脏体积明显缩小，外周血红细胞、血小板逐渐恢复正常. 结论：HIFU消融脾脏治疗实验性脾肿大和脾亢是可行和有效的，该技术可以作为临床脾亢治疗的新尝试.

【关键词】  高强度聚焦超声；犬；脾功能亢进；病理学

　　【Abstract】 AIM: To investigate the feasibility and effectiveness of HIFU ablation of spleen for the treatment of hypersplenism. METHODS: Fifteen healthy mongrel dogs were randomly divided into control group (group A), splenic vein ligation （SVL） group (group B), and SVL+HIFU treatment group (group C). Dogs in group C underwent splenic ablation with HIFU under direct vision via laparotomy 3 weeks after SVL. The peripheral blood cell counts, size of spleen, complications and histopathological changes were measured regularly. RESULTS: Thrombocytopenia, erythropenia and splenomegaly were presented in the dogs with SVL. Coagulative necrosis, vascular occlusion, thrombosis of spleen were demonstrated under induction of HIFU irradiation. Lesion was gradually absorbed and fibrosed or encapsulated. No major complications including abscess or rupture of spleen occurred. The size of spleen in group C was obviously smaller than that before therapy. The counts of PLT and RBC in group C increased gradually after therapy. CONCLUSION:  HIFU is feasible and effective for experimental splenomegaly and hypersplenism. This method holds promise for future clinical applications in therapy of hypersplenism.

　　【Keywords】 high intensity focused ultrasound; dog; hypersplenism; pathology

　　0引言

　　高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound, HIFU）是近年兴起的一项肿瘤治疗技术，主要通过热效应使靶区内组织温度骤升至65～100℃，使其发生凝固性坏死而发挥治疗作用. 随着研究深入，HIFU的非肿瘤适应证也正在逐步拓宽. 目前国外已有将HIFU用于脾脏破裂止血的动物研究［1］，结果表明通过HIFU可以使出血的脾脏组织发生凝固性坏死而达到止血的目的. 因此，我们设想能否通过HIFU对脾脏进行高温消融从而达到治疗脾亢的目的. 本研究我们使用便携式HIFU治疗仪开腹直视下对脾亢模型犬进行脾脏消融，观察HIFU消融后脾脏的病理学改变、体积及外周血像的变化和并发症的情况，探讨HIFU治疗脾亢的可行性、有效性.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　健康成年杂种犬15只(重庆医科大学动物中心提供并统一饲养)，体质量13～18 kg，雌雄不拘，随机分为：A组（对照组，n=4），B组［脾静脉结扎（SVL）组，n=4］，C组（SVL+HIFU治疗组，n=7）. B,C组犬参照刘全达等［2］的方法结扎脾静脉主干及其主要属支，术后常规护理，食水不限，3 wk末C组犬开腹直视下行HIFU脾脏消融. 便携式HIFU治疗仪由重庆医科大学医学超声工程研究所研制. 参数：输出功率50 W，声强3000 W/cm2，频率5.68 MHz. 治疗探头直径50 mm，焦距50 mm，除去设计长度38 mm，治疗探头的实际治疗深度为12 mm. 使用前探头及手柄20 g/L戊二醛中浸泡消毒30 min.

　　1.2方法

　　1.2.1直视下HIFU消融脾脏C组犬HIFU脾脏消融术前常规禁食禁水，速眠新肌注麻醉（0.1 mL/kg），腹部备皮，常规消毒铺巾后逐层入腹，暴露脾脏后，托出脾脏，与其他脏器间放置无菌干纱布隔热. 根据预实验结果，将治疗探头的移动速度控制在1.5 mm/s左右，扫描线长2 cm左右，连续扫描3次，即可以形成深度约1 cm, 长度2 cm, 宽度5 mm左右的损伤区域. 脾脏消融过程中，保持2 cm扫描线长、5 mm扫描间距连续辐照，可使单次辐照形成的损伤区域相互重叠，根据平移累计的总长度可以估算出脾脏消融的体积. 脾脏厚度约大于1.5 cm区域尽量予以辐照，使脾脏消融体积占总体积的30%以上. 操作过程中助手使用一次性注射器在脾脏表面缓慢滴注无菌生理盐水，使脾脏表面始终保持湿润，利于声波进入. 治疗结束，查看无出血后逐层关腹.

　　1.2.2观察项目记录HIFU消融脾脏后动物饮水、进食和活动等一般情况及死亡情况；记录各组犬实验初、3 wk末及9 wk末脾脏体积以及外周血像的变化（Sysmex K?4500全自动血球计数仪测量）. C组犬HIFU消融脾脏前后行肝肾功能以及血淀粉酶监测. C组犬于HIFU脾脏消融后即刻,7 d,14 d各随机抽选一只处死后剖腹取脾，40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，HE染色后镜检. 在实验末，处死全部B，C组犬，再次取脾镜检.

　　统计学处理：计量资料以x±s表示，采用SPSS13.0重复测量资料方差分析及两两比较，P<0.05表示差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1动物一般情况C组犬脾脏消融后有不同程度厌食，精神萎靡，于术后3～4 d基本恢复正常，腹部切口均愈合良好，所有实验犬无死亡.

　　2.2三组犬脾脏体积变化及C组犬脾脏消融体积入腹后用消毒无菌软尺测量脾脏长径、宽径和厚径(长径中点处)，通过V=π×(长×宽×厚)/6估算脾脏体积. A组犬3次所测脾脏体积差异无统计学意义(P>0.05)，B，C组犬SVL术后3 wk末的脾脏体积较结扎前明显增大. B组犬9 wk末脾脏体积较3 wk末有所缩小，但与SVL术前的体积比较仍明显增大，差异有统计学意义（P<0.05）. C组犬HIFU平均消融体积为脾脏总体积的43.8%，实验末脾脏体积与SVL术前比较差异已无统计学意义(P>0.05, 图1).

　　2.3HIFU消融术后脾脏病理组织学变化及并发症的发生情况B组犬9 wk末肉眼可见脾脏体积仍明显肿大，镜下可见脾脏被膜增厚、脾窦明显扩张、淤血，其内可见含铁血黄素颗粒等淤血性表现. C组犬HIFU消融后即刻脾脏剖面可见无血液溢出损伤区，中心可呈现焦炭状，周边有明显的充血带，与正常组织界限较清楚（图2），镜下见区正常脾组织结构被破坏，大量空泡形成，组织内各类细胞呈凝固性坏死改变，血管腔内可见血栓形成（图3A）；消融后7 d，镜下见坏死区组织崩解更加明显，交界区可见炎细胞浸润和成纤维细胞增生聚集. 消融后14 d，镜下见坏死区呈嗜伊红染色无结构状，交界区可见增生的肉芽组织，其内可见大量增生的纤维组织及新生的毛细血管. 9 wk末脾脏明显缩小，与大网膜有一定程度的粘连，未发生脾破裂、脾脓肿等并发症. 镜下坏死区组织逐渐被大量纤维组织取代或被纤维包裹并机化（图3B）.

　　2.4三组犬血常规变化B,C组犬血小板和红细胞分别于SVL术后第2 wk和第3 wk时开始显著降低，与A组同期比较差异有统计学意义(P<0.05). B组犬SVL术后9 wk末血小板和红细胞仍低于同期A组水平(P<0.05). C组犬血小板和红细胞于脾脏消融术后逐渐上升，分别于消融术后第2 wk和第3 wk开始接近同期A组水平(P>0.05, 图4,5）. 实验过程3组犬白细胞变化不明显，C组犬白细胞在HIFU治疗后虽出现短暂上升且稍高于正常组，但很快降至正常水平.

　　2.5其他生化指标C组犬在HIFU脾脏消融前后丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、胆红素、血肌酐、尿素氮及血淀粉酶等指标变化不显著，差异无统计学意义(P>0.05).

　　3讨论

　　随着对脾脏免疫功能认识的逐渐深入以及受微创治疗模式的影响，除脾切除和部分性脾栓塞术等常规治疗脾亢的方法外，临床医师还进行了许多新的尝试，其中包括化学物质消融脾脏(经皮脾内注射乙醇、醋酸等)和物理高温消融脾脏(微波、射频等)等方法［3-4］. HIFU是利用超声波的组织穿透性和可聚焦性等物理特征，将体外低能量超声波聚集在体内组织，主要通过热效应，使靶区组织发生凝固性坏死而发挥治疗作用［5］. 目前HIFU已经在肿瘤治疗领域发挥着重要作用［6］，而通过HIFU对脾脏进行高温消融，毁损部分脾脏，从而达到治疗脾亢的目的在理论上有一定的可行性.

　　实验中通过结扎犬脾静脉主干及其分支所形成的淤血性脾肿大模型，较好地模拟了门静脉高压时脾脏血液回流不畅的状态. 此模型可造成犬外周血小板和红细胞下降，并且脾脏的组织病改变符合门脉高压脾亢长期淤血后的表现，因此用此模型作为脾亢治疗的动物研究是比较理想的.

　　实验结果表明，HIFU辐照后脾脏可以形成明确的凝固性坏死，同Noble等［1］HIFU脾脏止血的研究中观察到的一致. HIFU除了直接损伤靶区组织外，其对靶区内微血管、毛细血管网的破坏亦可使局部组织血流灌注障碍，进一步加强HIFU对靶区的生物学效应［7］. 在我们的病理学观察中同样发现靶区脾脏组织出现微血管坏死和血管腔内血栓形成. 因此HIFU对脾脏辐照后局部发生的微栓塞将进一步加重脾脏组织的损伤. 通过观察，HIFU辐照脾脏后，其病理损伤?修复的过程符合一般的病理学转归，但正是这一损伤?修复过程，使脾脏的结构，尤其是过滤血细胞的脾索、脾血窦被破坏，取而代之的是纤维组织或包裹机化的坏死组织，由此削弱了脾脏吞噬、破坏血细胞的能力，从而产生部分脾切除效应.

　　实验犬经开腹直视下HIFU消融脾脏后，脾脏体积较治疗前明显缩小，并接近正常大小. 外周血下降的血小板和红细胞在治疗后也逐渐上升，与外科全脾切除术相比，血小板并没有异常升高，提示直视下HIFU消融脾脏对实验性脾亢的治疗是有效的，且不会发生类似脾全切后因血小板过度升高而导致的血液高凝状态. 治疗后实验犬虽然出现了不同程度的精神萎糜、厌食，但于1wk左右的时间基本恢复正常. HIFU治疗后实验犬无脾破裂、脾脓肿等并发症发生，亦无意外死亡，治疗前后实验犬的肝肾功能和血淀粉酶亦无明显异常，表明HIFU消融脾脏对实验犬其他重要脏器无明显影响.

　　综上所述，利用HIFU消融脾脏治疗实验犬淤血性脾肿大、脾亢是有效的，作为前期研究，本研究是通过开腹对脾脏进行消融治疗，很多地方不同于HIFU体外治疗，我们将进一步对体外HIFU消融脾脏进行相关的基础和临床研究.

【】
  　　［1］Noble ML,Vaezy S,Keshavarzi A,et al.Spleen hemostasis using high?intensity ultrasound:survival and healing［J］.J Trauma,2002,53(6):1115-1120.

　　［2］刘全达,马宽生,何振平,等.快速建立继发性脾功能亢进的犬动物模型［J］.第三军医大学学报,2003,25(4):301-304.

　　［3］付敏,陈耀凯,王新国,等.经皮脾内无水酒精注射治疗脾功能亢进18例［J］.世界华人消化杂志.2002,10(8):985-986.

　　［4］马宽生,吴乔,刘全达,等.射频消融治疗脾功能亢进症的临床研究［J］.中华外科杂志,2004,42(15):944-946.

　　［5］Kohrmann KU,Michel MS,Steidler A,et al.Technical characterization of an ultrasound source for noninvasive thermoablation by high?intensity focused ultrasound［J］.BJU Int,2002,90(3):248-252.

　　［6］Chen WZ,Wang ZB,Wu F,et al.Use of High intensity focused ultrasound for treating malignant tumors［J］.Chin J Clin Oncol, 2004, 1(1): 15-20.

　　［7］Vaezy S,Marti R,Kaczkowski P,et al.Use of high?intensity focused ultrasound to control bleeding［J］.J Vasc Surg,1999,29(3): 533-542.