CDMP1诱导大鼠脂肪干细胞体外成软骨细胞的实验研究

【摘要】  目的： 应用软骨形态发生蛋白（CDMP1）体外诱导SD 大鼠脂肪干细胞向软骨方向分化，探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性以及CDMP1诱导的最佳剂量. 方法： 无菌取8只SD大鼠腹股沟脂肪组织，脂肪干细胞体外培养至第二代，以1×104/孔密度接种于24孔培养板里，12 h 后加入诱导液（10 mL/L新生牛血清?DMEM培养液, CDMP1），分ABCD四组（A组：50 μg/L CDMP1 +基础培养液; B组：100 μg/L CDMP1+基础培养液；C组：150 μg/L CDMP1+基础培养液；D组：基础培养液 ），以D组为阴性对照组. 诱导14 d，倒置显微镜观察细胞形态的变化，MTT法测定CDMP1对其增殖分化能力的影响，行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色. 结果： 诱导后可见脂肪干细胞形态由长梭型明显向软骨细胞的多角形方向转变. MTT法测定CDMP1对脂肪干细胞的增殖能力提高，其中以C组为最，但ABC三组之间两两比较无统计学意义，故提示CDMP1诱导的最佳浓度约为50 μg/L . 甲苯胺蓝染色法示糖胺聚糖（GAG）均匀分布于基质中，免疫组化示诱导组Ⅱ型胶原表达阳性，对照组未见阳性表达. 结论： CDMP1诱导 大鼠脂肪干细胞可以分泌软骨特异性基质糖胺聚糖（GAG）和Ⅱ型胶原，并使其向软骨方向增殖分化，以50 μg/L 为CDMP1诱导的最佳浓度，并有望成为软骨组织工程种子细胞的新来源的方法之一.

【关键词】  软骨形态，发生蛋白；脂肪干细胞；软骨细胞；胶原Ⅱ型

     0引言

    创伤、骨性关节炎(OA)以及关节软骨病都能造成软骨组织损伤，严重影响患者的生活质量. 而关节软骨的损伤是不易修复的. 由于软骨自发修复能力的局限性, 轻度关节软骨损伤会使损伤甚至退变. 关节软骨的退变是临床的挑战之一，它缺乏令人信服的策略［1］. 最近，组织工程作为一种新方法的出现，它是联合种子细胞，支架和生物活性因子，建造功能性的新组织来代替损伤软骨. 这就使人们致力于理想的种子细胞，支架材料和生物活性因子的的研究当中.  Katayama等［2］用CDMP1基因转染兔骨髓基质干细胞修复兔关节软骨缺损，在用 CDMP1转染同源 BMMC植入兔关节软骨缺损处8 wk后， 修复的软骨表面形态可以与分化成熟的透明软骨相比拟，而且软骨下组织也完全由接近宿主软骨下骨的新生厚层骨组织修复. 这表明CDMP1能诱导骨髓基质干细胞增殖分化成软骨细胞. Chang等 ［3］在小鼠皮下及肌肉内注射CDMP1可诱导软骨组织形成，提示CDMP1具有诱导中胚层来源间质组织分化成软骨的能力. 本实验我们利用CDMP1体外诱导SD大鼠脂肪干细胞向软骨细胞方向增殖分化，检测诱导后细胞分泌软骨细胞特异性基质的能力，探索CDMP1诱导脂肪干细胞的合适剂量，为软骨组织工程提供一种新的种子细胞来源方法.

    1材料和方法

    1.1材料新生牛血清（GIBCO），高糖DMEM（GIBCO），CDMP1 （美国），MTT（Sigma），II 型胶原单克隆抗体（博士德），即用型SABC试剂盒（博士德），倒置相差显微镜. 7日龄SD仔鼠8 只，雌雄不限（购自第四军医大学实验动物中心）.

    1.2方法

    1.2.1ADSCs的分离、原代培养和传代无菌条件下切取SD仔鼠腹股沟的脂肪组织，剔去细血管，D?Hank?s液反复吹洗，剪碎脂肪组织，1000 r/min离心8 min，弃上清，加入1倍体积的10 mg/L胶原酶Ⅰ 37℃ 消化60 min,用等体积的10 mL/L新生牛血清?DMEM培养液中和，过200目筛网，900 r/min离心8 min，弃上清，加10 mL/L新生牛血清?DMEM培养液，小心吹打约100 次，分装接种于25 cm2的培养瓶，置37℃ 50 mL/L CO2的培养箱里孵育. 24 h后首次换液，弃去未贴壁的细胞. 以后每2 d换液1次，待细胞生长融合至80%时传代，用2.5 g/L胰蛋白酶37℃消化约5 min, 10 mL/L新生牛血清?DMEM培养液中和，900 r/min离心8 min . 最后以1×104/cm2密度接种于新的25 cm2培养瓶中，置37℃ 50 mL/L CO2培养箱中孵育，每隔2 d换液1次.

    1.2.2细胞爬片及成软骨细胞诱导取生长良好的第二代ADSCs 细胞以1×103个/孔的密度接种于2 块（第一块用来做免疫组化，第二块用来做甲苯胺蓝染色）24孔的培养板里，孔底放置由多聚赖氨酸包被的盖玻片. 每板分ABCD四组: 对照组（D 组）加基础培养液（10 mL/L新生牛血清?DMEM）培养，诱导组（A，B，C 组）于细胞爬片12 h后，分别加入相应的诱导液（A 组：50 μg/L  CDMP1 +基础培养液；B 组：100 μg/L CDMP1 +基础培养液; C 组：150 μg/L +基础培养液）. 每2 d换液一次. 37℃ CO2箱里培养14 d.

    1.2.3MTT法测定CDMP1对ADSCs增殖的影响取第2代ADSCs细胞，以1×103个/孔密度接种于5块平底96孔培养板里. 每板分ABCD四组，对照组(D 组)加基础培养液，诱导组（A，B，C 组）加相应的诱导培养液（具体同1.2.2）. 每隔1 d检测1块，分析CDMP1对ADSCs的增殖能力的影响.

    1.2.4Ⅱ型胶原免疫组织化学的检测细胞爬片第14 d，取第一块24孔培养板，取出盖玻片，950 mL/L乙醇固定15 min，PBS洗2遍，30 mL/L H2O2封闭内源性过氧化物酶，5 g/L BSA封闭37℃ 25 min，湿盒内加1∶100的一抗（兔抗大鼠II 型胶原单克隆抗体），4℃过夜.  湿盒内加二抗（兔IgG），37℃  30 min. PBS漂洗后，二胺基联苯胺（DAB）显色，苏木精轻度复染，中性树胶封片.

    1.2.5甲苯胺蓝染色细胞爬片第14日，950 mL/L乙醇固定15 min，甲苯胺蓝染色5 min，中性树胶封片.

    统计学处理： 采用SPSS 10.0软件进行统计分析，试验结果用x±s表示，不同组间比较采用方差分析及LSD? t检验. P≤0.05认为具有统计学意义. 

    2结果

    2.1细胞形态变化原代ADSCs呈圆形，胞体透亮，折光性好，12 h后少量贴壁，24 h后大部分贴壁，贴壁细胞逐渐变成长梭形，呈簇分布. CDMP1诱导3 d后，A, B, C三组的形态未见明显变化，诱导1 wk后，长梭形的细胞明显向成软骨的多角形方向变化. 诱导2 wk后， A,  B, C三组大部分细胞均已变成多角形（图1A）. 对照组 D 细胞形态未见变化（图1B）.

    2.2细胞增殖测定MTT法测定CDMP1对ADSCs增殖的影响，发现诱导组A（n=25），诱导组B（n=25），诱导组C（n=25）的细胞比对照组D (n=25)同期增殖力强，尤以C 组为最. 10 d后，A，B，C三组细胞仍有增殖趋势，D组细胞则已成下降趋势（图2）. 各组细胞在第10日的A值，经方差分析及LSD? t检验，A(1.40±0.21)，B(1.41±0.20)，C(1.65±0.20)三组分别与D(0.57±0.11)组比较有统计学意义（P<0.05）；但A，B，C三组之间并无统计学意义（P>0.05）.

    2.3糖胺聚糖(GAG)定性检测诱导组甲苯胺蓝染色，胞内基质均匀蓝染，提示GAG大量沉积（图3A）. 对照组甲苯胺蓝染色呈阴性（图3B）.

    2.4Ⅱ型胶原免疫组化诱导组细胞基质内呈棕黄色颗粒 ，且在Ⅱ型胶原表达越密集的区域染色越强（图4A），对照组Ⅱ型胶原免疫组化染色阴性（图4B）. A: 诱导组； B: 对照组.

    3讨论

    损伤的关节软骨自我修复的能力极其有限. 关节面过度损伤的效果是不乐观的，通常容易为骨性关节炎［4］. 虽然关节软骨是一种代谢活跃的组织, 但是基质中软骨细胞更新率相对低，而且软骨组织本身缺乏血供来支持软骨修复和重塑［5］. 经过多年的努力，人们找到了一系列关于软骨修复的方法，诸如：① 软骨内固定；② 降低关节面应力及保持关节活动；③ 关节镜下关节腔灌洗和清理术等.  近年来，组织工程倍受学者的青睐. 但种子细胞的来源和细胞生长调节因子是组织工程的难题之一.

    　　 脂肪干细胞（ADSCs）能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向诱导转化. ADSCs有其自身一系列的优点：① 脂肪在人体分布广，来源广. ② 吸脂减肥已是一种时尚，并发症少，人们易于接受. ③ 有良好的增殖能力. ④ 培养相对容易. 因此，脂肪组织是最好的干细胞来源，有非常重要的研究和应用价值［6］.

    　　Lee等通过深入的研究，克隆出了生长分化因子5，6，7，并发现短足畸形鼠体内生长分化因子5的变异，进一步证实： Hunter?Thompson型软骨发育不良、C型短趾(短指)畸形、Grebe型软骨发育不良伴有严重的肢体短小和形态发生障碍的患者体内，CDMP1发生突变.  因此，BMPs和CDMPs对骨与软骨以及其他组织的形态发生起关键性作用 ［7］. 现已了解骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)家族中一类特异生长因子?软骨源性形态发生蛋白(cartilage?derived morphogenetic protein,  CDMP)  在软骨发育过程中发挥重要的调控作用.  在目前所发现的BMP全部家族成员中，CDMP1是最为特异的与软骨形态发生与发育相关的一类生长因子，CDMP在出生后可继续维持正常软骨组织的生长并促进关节软骨的损伤修复过程. 它主要通过调节间质前体细胞的分化、参与了软骨组织的发生、生长与损伤修复的几乎全部生物学过程，是重要的调节软骨细胞分化的生长因子［8-9］. 国内崔磊，曹谊林等［10］也用CDMP1诱导真皮成纤维细胞表达软骨细胞表型.

    目前尚未见用CDMP1诱导脂肪干细胞分化成软骨细胞的报道. 本实验我们利用CDMP1成功的诱导SD大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化. MTT法测定CDMP1对ADSCs增殖的影响中发现：A，B，C三组均比D组增殖力强，其中以C组为最，但A，B，C三组之间比较并没有统计学意义，且CDMP1价格高昂，因此作者认为：CDMP1诱导脂肪干细胞理想浓度应为50 μg/L. 这与文献中的CDMP1诱导MSCs和真皮成纤维细胞的最佳浓度为100 μg/L不符，分析其原因，可能是由于诱导的种子细胞不同所致.

【文献】
  ［1］ Gelse K, Schneider H. Ex vivo gene therapy approaches to cartilage repair ［J］. Adv Drug Deliv Rev, 2006,58:259-284.

［2］ Katayama R, Wakitani S, Tsumaki N, et al. Repair of articular cartilage defects in rabbits using CDMP1 gene?transfected autologous mesenchymal cells derived from bone marrow［J］. Rheumatology, 2004,43:980-985.

［3］ Chang SC, Hoang B, Thomas JT, et al. Cartilage?derive morphogenetic proteins. New members of the transforming growth factor?beta super family predominantly expressed in long bones during human embryonic development ［J］. J Biol Chem, 1994,269: 28227-28234.

［4］ Marlovits S, Zeller P, Singer P, et al. Cartilage repair : Generations of autologous chondrocyte transplantation ［J］ . Eur J Radiol, 2006,57:24-31.

［5］ Chang CH, Kuo TF, Lin CC, et al. Tissue engineering?based cartilage repair with allogenous chondrocytes and gelatin?chondroitin?hyaluronan tri?copolymer scaffold: A porcine model assessed at 18, 24, and 36 weeks［J］. Biomaterials, 2006,27:1876-1888.

［6］ 余方圆，卢世璧，袁玫，等. 脂肪干细胞向软骨细胞方向诱导的初步研究 ［J］. 矫形外科杂志，2004,12(10):762-764.

［7］ 张益民，姜鑫，李汉秀. 骨形态发生蛋白及其相关结合蛋白在骨与软骨形态发生中的作用 ［J］ . 中华医学杂志，2006,6（7）:758-760.

［8］ Tsumaki N, Tanaka K, Arikawa?Hirasawa E, et al. Role of CDMP 1 in skeletal morphogenesis：Promotion of mesenchymal cell recruitment and chondrocyte differentiation ［J］. J Cell Biol, 1999,144: 161-173.

［9］ Erlacher L, Ng CK, Ullrich R, et al. Presence of cartilage?derived morphogenetic proteins in articular cartilage and enhancement of matrix replacement in vitro［J］. Arthritis Rheuma, 1998,41: 263-273.

［10］ 崔磊，尹烁，邓辰亮，等. 软骨形态发生蛋白1诱导真皮成纤维细胞表达软骨细胞表型的实验研究 ［J］ . 中华医学杂志， 2004,8 (15):1304-1309.