高渗透压环境下OREBP对AQP5的调控

【摘要】  目的： 探讨高渗透压环境下OREBP对AQP5的调控作用. 方法： 利用qRT?PCR和Western Blot，研究高渗透压刺激下，MLE?15细胞OREBP和AQP5的mRNA和蛋白水平的变化；运用RNAi技术抑制OREBP表达后，观察AQP5 mRNA及蛋白水平随高渗刺激的变化；探讨AQP5基因上游不同区域对Luciferase表达的启动及高渗环境下表达增强作用，用RNAi技术研究这种增强表达作用对OREBP的依赖性. 结果： 高渗透压刺激下，OREBP和AQP5的mRNA水平在12, 18 h达到峰值，两者蛋白水平也分别在12, 18 h达到峰值，RNAi抑制OREBP的表达后，AQP5对高渗的反应性消失. Luciferase实验表明在?593至?144区域内存在启动子，?2563至?2055区域存在ORE. 结论： 高渗透压环境下，OREBP通过与AQP5基因上游的ORE结合，调控AQP5的表达.

【关键词】  渗透压反应增强子结合蛋白；水孔蛋白5；渗透压反应增强子

     0引言

    水通道蛋白（aquaporin, AQP）家族由具有氨基酸序列同源性和两个NPA（Asp?Pro?Ala）结构域的13个蛋白组成（AQP0?AQP12），其广泛存在于分泌细胞和吸收细胞，具有调节细胞水通透性的重要功能［1］. AQP5基因于1996年，被Lee等人成功克隆，该蛋白在肺，唾液腺和泪腺等组织呈高表达，特别是在成熟的肺泡上皮的1型上皮（alveolar epithelial type 1, AT1）中高表达，使AT1细胞相对于其他细胞具有更高的水通透性［2］. 近来，在体内试验中发现，AQP5同维持肺泡表面液体渗透压以及细胞体积密切相关，体外研究也发现高渗条件能诱导细胞株AQP5的高表达，同时也发现这一细胞反应同ERK依赖性通路有联系［3］，但高渗透压如何诱导AQP5上调表达的具体机制依然未知.

    渗透压反应增强子结合蛋白（osmotic response element?binding protein, OREBP）是哺乳动物细胞内唯一已知的渗透压相关的转录因子. 在高渗环境下，OREBP 同一系列渗透压相关基因，如：肌醇，甜菜硷，肌醇转运蛋白等的渗透压反应增强子（osmotic response enhancer, ORE）结合，增强这些基因的表达，维持细胞的正常生理功能［4］. 有研究表明，细胞外高渗透压激活细胞内相关激酶： Fyn, P38, ATM等，使OREBP磷酸化，并进入胞核，启动相关基因表达［5-6］. 本课题探讨高渗透压环境下，OREBP与AQP5两者的mRNA与蛋白水平的相关变化规律，探讨OREBP对AQP5的调控作用及相关机制.

    1材料和方法

    1.1材料MEL?15细胞株由Jeff Whitsett博士（辛辛那提大学，美国）惠赠. RPMI1640，L?谷氨酰胺，FBS，青/链霉素合剂购自Gibco. 氢化可的松，转铁蛋白，雌二醇，硒盐，三梨醇等购自Sigma. Trizol，预染Marker, Lipofectamine2000购自Invitrogen，M?MLV逆转录试剂盒为Promega产品，定量PCR试剂，引物及Taqman探针购自Applied Biosystems. 随机引物及PCR引物由上海生工合成，克隆用PCR试剂购自Strategene，限制性内切酶为NEB产品. OREBP?siRNA(NFAT5?siRNA)，All Star negative control siRNA及siRNA转染试剂购自Qiagen. pGL4.18［luc2P/Neo］载体及Luciferase检测试剂盒购自Promega. 荧光定量PCR仪为Applied Biosystems 7300，荧光分光光度计为Perkin Elmer Victor3. Anti?OREBP 购自Affinity BioReagents, Anti?AQP5抗体购自Chemicon, CA. ECL试剂为Pierce产品. 其他常用试剂及设备本试验室提供.

    1.2方法

    1.2.1细胞培养按报道［7］方法进行细胞培养，RPMI1640（加10 nmol/L氢化可的松，5 mg/L胰岛素，5 mg/L转铁蛋白，10 nmol/L雌二醇，5 mg/L硒盐，2 mmol/L L?谷氨酰胺，10 mmol/L HEPES, 10万U/L霉素，100 mg/L链霉素，20 g/L FBS），50 mL/L CO2, 37℃. 以上完全培养基中加入200 mmol/L三梨醇，构成高渗压培养基（500 mmol/L）. 渗透压由Vapro/vapor渗透压计(Wescor)检测.

    1.2.2逆转录定量PCR按Trizol使用说明书提取细胞总RNA，经A260 nm/280nm定量，分析纯度，琼脂糖电泳评价.  取RNA经M?MLV逆转录成cDNA，按照ABI TaqMan Master Mix说明书，加入相应引物及探针进行荧光定量PCR检测，每个样本做三点重复. 所得Ct值减去Actin Ct值得ΔCt值，取2?ΔCt即为该样本OREBP及AQP5与Actin mRNA 拷贝数的比值. 每次检测的同时，将一个高拷贝样本做10倍梯度稀释，取5个梯度点进行检测，然后用软件拟合标准曲线，当R2>0.99时，实验结果才为可信. 检测OREBP mRNA（AF453571）的引物和探针序列如下：上游引物：  5′?GTGACAACACTTCTTTCTCAGCAAA?3′, 下游引物： 5′?TTCCATGTTCTGACTGCTGTTCA?3′，探针5′?6FAM?CCAGAGACTTCCCCACTGGCCTCCT?TAMRA?3′，Actin的引物和探针序列为：上游引物： 5′?TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA?3′下游引物： 5′?CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG?3′探针5′?6FAM?ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT?TAMRA ?3′. 检测AQP5 mRNA（NM001651）的引物和探针序列如下：上游引物： 5′?GGGGCTGGCATCCTCTACGGT?3′下游引物： 5′?CAAAAGAGCGGGCTGGGTTCA?3′，探针： 5′?6FAM? TCGCCTCCACTGACTCCCGCCGCAC ?TAMRA?3′. 实验重复3次.

    1.2.3Western Blot不同处理，不同时间点的细胞经冰冷PBS洗3次，使用lysis buffer（20 mmol/L Tris?HCl, pH 7.5，150 mmol/L NaCl, 10 mL/L   Triton X100, 1 g/L SDS, 100 mL/L)甘油，1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA, 1 mmol/L DTT, 1 mmol/L PMSF,  1×proteinase inhibitors cocktail（Roche）裂解细胞，冰上孵育20 min，裂解产物4℃，15 000 g离心30 min，上清液即为细胞蛋白提取物. 使用Bio?Rad protein assay试剂测定提取物蛋白浓度，按分子克隆实验指南（2001年，第3版）进行Western Blot检测蛋白，每泳道上样50 μg. Anti?OREBP抗体及Anti?AQP5抗体按1∶1000稀释，4℃孵育过夜，Anti?Actin抗体1∶2000稀释，室温孵育3 h. 实验重复3次.

    1.2.4载体构建使用Strategene PfuUltraTM High?Fidelity DNA Polymerase扩增AQP5上游不同片断，插入pGL4.18载体的XhoI和HindIII两个位点，载体经由测序鉴定，然后使用Qiagen Maxi Prep Kit提取质粒. 引物序列如下：下游引物： Prev：5′? GGCAGCTT?

    TCCGACCTCGGGGCGTCTAG?3′ ( +3到+22)，上游引物： P1： 5′?GGCTCGAG GGGGTGAGGCGGGTCAGGAT?3′ (?114至?85)，P2： 5′?GGCTCGAG AGGGGAGGTGGAGGAAGA?3′ (?593至?576)，P3： 5′?GGCTCGAG GACAGAAACAAAGAAAGGCACA?3′ (?961至?940)，P4： 5′?GGCTCGAG GGCAGGAACAATAGCGGGGTTT?3′ (?1571至?1550)，P5： 5′?GGCTCG?

    AGCCCTCATTAGTTCAAATCTT?3′ (?1974至?2055)，P6： 5′?GGCTCGAG ACCAGAAGACAGGCGGAGC?3′ (?2563至?2545). 各质粒命名为： ?144pGL4.18, ?593pGL4.18, ?961pGL4.18，?1571pGL4.18，?2055pGL4.18，?2563pGL4.18.

    1.2.5细胞转染使用Qiagen HiPerFect Trasfection Reagent 转染siRNA入35 mm培养皿内培养过夜的细胞，siRNA终浓度为50nmol/L ，然后在不同时间点（0, 24, 48, 72 h），阴性对照在转染48 h后，裂解细胞提取蛋白，分析OREBP表达情况. 选择在转染siRNA后合适的时间点，进行高渗诱导AQP5表达实验，及在24孔板内，使用lipofectamine2000转染构建的luciferase载体，空载体及Renilla载体， pGL4.18载体与Renillia载体的比值为0.6 μg： 0.2 μg，三孔重复，实验重复3次.

    1.2.6Luciferase活性测定转染后细胞，再高渗培养基处理18 h后，按Promega Renilla Luciferase Assay System试剂盒说明检测Luciferase和Renilla活性. 用Renilla活性提示转染效率，Luciferase/Renilla比较不同处理细胞的荧光素酶活性.

    统计学处理：  数据使用GraphPad Prism4.0进行统计分析和做图，分析方法为方差分析及LSD?t检验，P<0.05为有统计学意义.

    2结果

    2.1OREBP和AQP5 mRNA及蛋白水平随高渗处理的时相变化对数生长期细胞经高渗性培养基（500 mmol/L）处理0, 6, 12, 18, 24 h后，换回等渗培养基（300 mmol/L）处理6, 12 h.  7个时间点分别提取细胞总RNA和总蛋白，使用Real?Time PCR 和 Western Blot检测OREBP和AQP5 mRNA及蛋白水平的变化(图1，2).

    A： 细胞高渗处理0, 6, 12, 18, 24 h后转入等渗培养基处理6, 12 h, 7个时间点AQP5 mRNA 与 Actin mRNA的比值，aP<0.05 vs T0;  B：  细胞高渗处理0, 6, 12, 18, 24 h后转入等渗培养基处理6, 12 h,  7个时间点OREBP mRNA 与 Actin mRNA的比值，aP<0.05 vs T0.

    图1不同处理后AQP5和OREBP mRNA水平检测

    2.2RNAi抑制OREBP表达后AQP5 mRNA和蛋白水平随渗透压的变化使用RNAi抑制OREBP的表达，观察AQP5在高渗处理下的表达水平变化(图3). 阴性对照siRNA对OREBP的表达无影响，OREBP siRNA转染细胞24 h后，成功抑制了OREBP在等渗条件下的表达，转为高渗培养基处理12 h后，OREBP表达水平没有提高（图3A）. OREBP表达受抑制细胞，高渗处理12及18 h后，AQP5 mRNA 和蛋白水平也不见提高（图3B）.

    A： 细胞高渗处理0, 6, 12, 18, 24 h后转入等渗培养基处理6, 12 h,  7个时间点AQP5 蛋白水平Western Blot检测; B：细胞高渗处理0, 6, 12, 18, 24 h后转入等渗培养基处理6, 12 h,  7个时间点OREBP蛋白水平Western Blot检测.

    图2不同处理后AQP5和OREBP蛋白表达水平

    A： RNA干扰后OREBP蛋白水平检测; 1： 未转染siRNA; 2：转染阴性siRNA 48 h;  3, 4: 分别转染OREBP?siRNA 24, 48 h; 5： 转染OREBP?siRNA 48 h后，高渗培养基处理12 h.  B：  OREBP RNAi后，AQP5蛋白水平检测; 1： 未转染siRNA; 2： 转染OREBP?siRNA  48 h;  3，4：转染OREBP?siRNA  48 h后分别高渗培养基处理12，18 h.

    图3OREBP RNAi后对AQP5表达水平的影响

    2.3AQP5的ORE及启动子的筛选OREBP对基因转录的调控是通过与基因上游的渗透压反应增强子（ORE）结合后，发挥转录因子活性，从而增强基因的转录. 同时我们也希望对AQP5的启动子所在区域进行一定层面上的探讨. 利用PCR将AQP5之前不同区域的DNA序列克隆入Luciferase表达载体（pGL4.18），与Renilla表达载体共转染细胞，研究不同区域DNA序列在等渗和高渗环境下启动Luciferase表达的能力（图4）. ?593 pGL4.18 Luciferase 活性较?144 pGL4.18有明显增强，再往前区域对Luciferase活性并没有更大的提高. 高渗刺激下?2563 pGL4.18 Luiferase活性较之其他载体有近一倍的增高，?2563至?2055区域存在与高渗相关的增强子. 采用RNAi抑制OREBP表达，成功阻断了?2563至?2055区域在高渗环境下对Luciferase活性的增强作用. 细胞转染OREBP siRNA 48 h后，转染?2055pGL4.18和Renilla，高渗培养基诱导12 h后，检测Luciferase和renilla活性. 空载体无信号，未转染和转染阴性siRNA组对高渗性诱导无影响，OREBP siRNA转染后明显抑制高渗透压对luciferase活性的诱导增强作用，P<0.05 vs no siRNA control,  P<0.05 vs negative siRNA control.

    空白载体(pGL4.18)无信号，?593pGL4.18，?961pGL4.18，?1571pGL4.18，?2055pGL4.18，?2563pGL4.18在高渗和等渗条件下均具有较强信号，而?144pGL4.18信号弱，aP<0.05 vs ?144 pGL4.18. ?2563pGL4.18在高渗处理下的信号明显增强，cP<0.05 vs ?2055pGL4.18.

    图4AQP5基因上游的启动子和增强子筛选

    3讨论

    渗透性溶质，如三梨醇，蔗糖，氯化钠，尿素等都是在生理环境形成渗透压梯度的溶质，故通常利用这些物质调节培养基的渗透压，进行体外研究. 但报道［3］，只有三梨醇，蔗糖，氯化钠三种物质构成的高渗环境对AQP5的活性有影响. 而最近文献［7］采用了三梨醇作高渗溶质研究AQP5，故本课题采用在普通培养基中加入200 mmol/L三梨醇，提高培养基渗透压至500 mmol/L.

    本课题发现OREBP mRNA 和蛋白水平的达峰时间比文献报道推迟6 h左右［9］，可能的原因是采用的细胞株有不同，而且我们采用的时间点间隔时间为6 h，该文献则为2 h（mRNA水平），4~12 h（蛋白质水平）. 另外，OREBP水平在高渗处理12 h后达到峰值，之后缓慢下降，可能跟高渗透压长时间处理有关，细胞的生理功能因此受影响，蛋白质合成受抑制.

    在?593至?144区域内可能存在着AQP5的启动子. 通过BDGP（Berkeley Drosophila Genome Project, www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）在线工具对AQP5基因上游序列进行搜索发现，在该区域存在唯一一个启动子： ?231 ACGTCGGACGGCCGGACCGCCCTGCAGGACCCAGCCCGGCCGCCCGCCCC ?182. 实验提示?2563至?2055区域存在与高渗相关的增强子. ORE的序列模式为：YGGAANNNYNY［8］(Y为 T或C，N为任一碱基)，经过DNA序列比较，发现该区域存在一个ORE序列：?2267 TGGAAGAGCCT?2257，因此可见生物信息学分析结果与本实验数据相符.

    Hoffert等［3］使用细胞间调节激酶（extracellular regulated kinase, ERK） 特异性抑制剂抑制ERK活性，高渗环境对AQP5的诱导作用消失，但是人为激活ERK并不能上调AQP5的表达，提示ERK与高渗环境下AQP5的上调表达有关，但还有很多未知的因素还没有发现. 哺乳动物唯一已知的渗透压相关转录因子OREBP调控着许多与细胞适应外界环境渗透压变化相关基因的表达. 高渗刺激使OREBP磷酸化，从胞浆进入胞核，启动基因表达. 而且也有文献证实［6］，高渗刺激磷酸化OREBP，使之活化，同许多激酶,如：Fyn，P38，的活性变化有关. 因此我们有这样的设想：高渗环境通过细胞膜受体或某一通路激活胞浆内相应激酶，然后位于胞浆的OREBP被磷酸化，磷酸化后的OREBP进入细胞核，与AQP5上游的ORE结合，增强AQP5的表达. 但是另有文献报道，在C2C12细胞中，高渗刺激可以同时上调AQP5和P38的表达，而抑制P38活性，并不能抑制AQP5的表达［10］. 可见，这一信号通路中存在大量未知因素，等待我们去探讨和研究. 渗透压变化－激酶－OREBP－AQP5信号通路模型的建立也需要大量的探索工作去证实.

    我们研究证实了高渗透压环境下，OREBP通过与AQP5上游的ORE结合，增强了AQP5的表达. 这不仅对探讨AQP5受体外渗透压变化调节的机制，而且对揭示细胞渗透压反应机制均有一定意义.

【文献】
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