bcr/abl融合蛋白对细胞DNA损伤修复功能的影响

          作者：史梦，冯文莉，黄世峰，曾建明，王小中   

【摘要】  目的： 建立稳定表达bcr/ablP210融合蛋白的小鼠转化细胞株BaF3?P210的DNA损伤模型，探讨bcr/abl融合蛋白对细胞DNA损伤修复功能的影响. 方法： 彗星实验检测不同浓度H2O2诱导的BaF3?P210细胞的DNA损伤建立DNA损伤模型，以空载体转染BaF3?MIGR1细胞为对照；用彗星实验对两组细胞在DNA损伤后的修复进行不同时间段的动态观测. 结果： 彗星实验确定了细胞DNA损伤模型的建立条件是：采用50 μmol/L终浓度的H2O2对BaF3?MIGR1细胞和BaF3?P210细胞进行染毒，H2O2作用温度和时间均为4℃，10 min. BaF3?P210细胞与BaF3?MIGR1细胞相比DNA损伤后修复时间缩短，在损伤后60 min即可达到完全修复，而后者在损伤后120 min才能完全修复（P<0.05）. 结论： 建立了表达bcr/ablP210融合蛋白的小鼠转化细胞株BaF3?P210细胞的DNA损伤模型，并发现bcr/abl融合蛋白可增强BaF3?P210细胞的DNA损伤后修复能力.

【关键词】  融合蛋白质类，bcr/abl；白血病，髓样，慢性；DNA损伤；DNA修复

     0引言

    　慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)的发生是由于 t(9；22)(q34；ql1)所致的bcr/abl融合基因编码产生具有强烈酪氨酸激酶活性的bcr/abl融合蛋白，该蛋白异常激活多种信号转导通路而导致血细胞的恶性转化［1］. bcr/abl融合基因的表达可能引起DNA损伤修复功能异常，与CML的发生、及耐药性表型密切相关，但具体机制仍然有待阐明［2-3］.  我们以表达bcr/ablP210融合蛋白转化细胞株BaF3?P210为对象，以空载体感染细胞株BaF3?MIGR1为阴性对照，经H2O2染毒后建立DNA损伤模型，并对细胞在DNA损伤后的修复进行动态观测，探讨bcr/abl对细胞DNA损伤修复功能的影响.

    1材料和方法

    1.1材料RPMI1640培养基和胎牛血清为Gibco公司产品；低熔点琼脂糖、溴化乙啶（EB）为Sigma公司进口分装，H2O2等试剂均为国产分析纯级产品；倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS），水平电泳仪（BIO?RAD公司）. bcr/ablP210转化细胞株BaF3?P210和空载体感染细胞株BaF3?MIGR1由本课题组构建. BaF3?P210细胞用含100 g/L FCS的PRMI 1640液培养于含50 mL/L CO2的37℃恒温培养箱中. BaF3?MIGR1细胞用含100 g/L FCS, 100 g/L WEHI?3条件培养基（细胞生长所需IL?3来源）的PRMI1640液培养，培养箱条件同前. 

    1.2方法

    1.2.1建立细胞的实验性DNA损伤模型BaF3?MIGR1细胞和BaF3?P210细胞细胞（1×108/L）分别用1, 10, 50, 100, 200    μmol/L终浓度的H2O2于4℃下染毒10 min，立即收集细胞进行彗星实验. 以上实验均以100 μmol/L  H2O2染毒的细胞作为阳性对照，同体积PBS处理细胞作为阴性对照.

    1.2.2检测细胞的DNA损伤后修复实验分组同前. 用造成DNA损伤的最佳条件对各组细胞（1×108/L）染毒后，用PBS洗涤两次除去H2O2，然后用PRMI 1640液重悬细胞，放入37℃培养箱继续培养. 取出部分染毒前和染毒后0, 30, 60, 90, 120 min的细胞，置于冰上终止DNA修复反应，收集细胞进行彗星实验.

    1.2.3彗星实验Singh等［4］的方法，并稍加改良. 即混合于低熔点琼脂糖中的细胞经1 h裂解，30 min解旋后，在25 V, 200 mA电场下电泳20 min，EB染色，倒置荧光显微镜下观察. 每个样品制片2张，每张载玻片随机选择50个细胞拍照. 用TriTek公司的彗星图像分析软件CometscoreTM 1.5分析实验结果. 以国际公认的Tail Moment(尾矩)为指标衡量DNA损伤水平及修复能力. Tail Moment为复合指标，定义为彗尾DNA百分含量和彗尾长度的乘积，单位为PIX（像素）.

    统计学处理： 实验独立重复3次，结果用x±s表示. 采用SPSS14.0统计软件包进行分析： 细胞实验性DNA损伤模型建立的实验结果数据在经对数转换为方差齐同资料后采用单因素方差分析进行组间均值比较，并进一步采用多个均数间两两比较的q检验进行多组间均数的比较；细胞在DNA损伤后的修复能力检测的实验结果数据采用重复测量资料的方差分析，以P<0.05为有统计学意义.

    2结果

    2.1细胞的实验性DNA损伤模型的建立在倒置荧光显微镜下观察到通过彗星实验检测到H2O2对细胞DNA损伤的图像(图1). BaF3?MIGR1细胞组和BaF3?P210细胞组的Tail Moment值方差不齐，在经对数转换后方差齐同（方差齐性检验P值分别为0.14和0.17）. 在H2O2的终浓度达到50 μmol/L时对BaF3?MIGR1细胞和BaF3?P210细胞造成明显的DNA损伤，其经对数转换后的Tail Moment值与0, 1, 10  μmol/L组相比差异有统计学意义（P<0.05,表1)；随H2O2浓度的增加，各组细胞DNA损伤加重，呈剂量?效应关系. 在后续的细胞DNA损伤后修复实验中，采用50 μmol/L终浓度的H2O2对各组细胞进行染毒. 

    A： DNA未受损伤的细胞大多数形态完整，呈圆形，无彗星尾巴； B，C，D： DNA受损伤的细胞.

    图1彗星实验检测H2O2对细胞DNA的损伤×200

    2.2细胞在实验性DNA损伤后的修复能力两组细胞的Tail Moment逐渐降低，说明随修复时间延长，细胞DNA损伤程度逐渐减轻，提示受损细胞在进行自我修复(F=480.33, P＜0.05)；BaF3?P210细胞组与BaF3?MIGR1细胞组相比DNA损伤后修复时间缩短,BaF3?P210细胞在修复30 min后就出现明显修复，60 min后已基本接近完全修复；BaF3?MIGR1细胞在60 min后才开始出现明显修复，120 min后修复完成(图2，3). 各组的阴性对照细胞在电泳后没有彗星细胞出现，说明在细胞的制备及电泳等实验过程中未对细胞造成额外的DNA损伤. 表1彗星实验检测各H2O2浓度下经对数转化后Tail Moment值

    图2彗星实验检测DNA损伤后修复时间与BaF3?P210细胞和BaF3?MIGR1细胞的Tail Moment的关系

    3讨论

    　真核细胞具有复杂的DNA损伤修复机制：它以DNA?PK, ATM, ATR等蛋白质为核心［5］，通过核苷酸剪切修复（NER）,误配修复（MMR）,同源重组修复（HRR）,非同源末端连接（NHEJ）等多种方式，构成了一个监控［6］. DNA损伤修复机制可以使细胞转化为正常细胞或进入细胞凋亡过程，对维持基因组的完整至关重要，而DNA修复能力的异常是多种肿瘤发生、以及耐药性产生的重要分子基础. 现有资料显示，bcr/abl的表达可引起一些DNA损伤修复蛋白，如非同源末端连接修复蛋白DNA?PKCS,基因组稳定蛋白BRCA1,同源重组修复蛋白RAD51,同源重组修复蛋白BLM等发生变化，从而与CML的疾病进展和耐药性表型相关，但其具体机制目前尚不清楚［2-3］.

    　　常用的DNA损伤诱导剂有H2O2、紫外线、电离辐射、DNA损伤药物如Idarubicin等. 在本实验中选择了易于控制剂量、能激活多种DNA修复方式、有代表性的H2O2处理作实验性损伤. 外源性的H2O2极易通过细胞膜进入细胞，产生高活性的自由基从而造成DNA分子的碱基修饰、DNA单/双链断裂等细胞损伤. DNA损伤程度则采用灵敏的彗星实验进行定量评价. 彗星实验又称单细胞凝胶电泳（SCGE），是一种快速、简便、灵敏地在单细胞水平检测有核细胞DNA断裂的技术.

    A: BaF3?P210（0 min）; B: BaF3?P210（60 min）;C: BaF3?MIGR1（0 min）; D: BaF3?MIGR1（60 min）.

    图3彗星实验观测的BaF3?P210细胞和BaF3?MIGR1细胞DNA修复形态×200

    实验中首先使用低浓度的H2O2作为诱导剂，以彗星实验检测到细胞DNA损伤的产生为标准，发现50 μmol/L终浓度的H2O2在4℃作用10 min，即可对BaF3?MIGR1细胞和BaF3?P210细胞造成明显的DNA损伤，从而建立了bcr/abl融合蛋白的小鼠转化细胞株BaF3?P210细胞及其空载体转染对照组BaF3?MIGR1细胞的DNA损伤模型. 继而对各组细胞DNA损伤后修复情况进行了动态的观测，结果显示：BaF3?P210细胞与BaF3?MIGR1细胞相比DNA损伤后修复时间缩短，在损伤后60 min即可达到完全修复，而后者在损伤后120 min才能完全修复.

    研究结果表明，bcr/abl融合蛋白可增强BaF3?P210细胞DNA损伤后修复能力. 其作用机制可能与bcr/abl引起一些DNA损伤修复蛋白发生变化从而造成细胞DNA损伤后修复能力异常相关. 该异常导致的白血病细胞增殖失控及凋亡受损可能是CML发病及耐药机制之一. 细胞DNA损伤修复能力如何受bcr/abl调控的具体机制目前正在进一步研究中. 因此，建立bcr/ablP210阳性细胞的DNA损伤模型及对细胞损伤后修复时间的观测对研究bcr/abl与DNA损伤修复的关系有着重要的意义，为进一步深入研究DNA损伤后修复提供了体外研究模型.

【】
  ［1］Goldman JM, Melo JV. Chronic myeloid leukemia?advances in biology and new approaches to treatment［J］. N Engl J Med, 2003,349(15):1451-1464.

［2］ Deutsch E, Jarrousse S, Buet D, et al. Down?regulation of BRCA1 in BCR?ABL?expressing hematopoietic cells［J］. Blood, 2003,101(11): 4583-4588.

［3］ Slupianek A, Gurdek E, Koptyra M, et al. BLM helicase is activated in BCR/ABL leukemia cells to modulate responses to cisplatin［J］. Oncogene, 2005,24(24)3914-3922.

［4］ Singh NP, McCoy MT, Tice RR, et al. A Simple technique for quantitation of low levels fo DNA damage in individual cells［J］. Exp Cell Res,1988,175(1):184-191.

［5］ Durocher D, Jackson SP. DNA?PK, ATM and ATR as sensors of DNA damage: varations on a theme［J］？Curr Opin Cell Biol, 2001,13(2): 225-231.

［6］Begley TJ, Samson LD. Network responses to DNA damaging agents［J］. DNA Repair, 2004,3(8?9):1123-1132.