质粒重组体在体转染大鼠心肌的可行性

             作者：郭敏，郎明健，曾秋棠，杨汉东，闵新文   

【摘要】  目的： 探讨应用阳离子脂质体lipofectamine2000在体转染质粒重组体基因至大鼠心肌的可行性. 方法： 构建含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的真核表达质粒. 将 22只雄性SD大鼠随机分为4组：阴性对照组（Ⅰ组，n=4），心肌注射组（Ⅱ组,n=6），尾静脉注射组(Ⅲ组，n=6)和冠状动脉灌注组（Ⅳ组，n=6）.分别采用心肌局部注射、尾静脉液压注射、冠状动脉灌注三种不同方式实施在体心肌转染. Ⅱ～Ⅳ组于转染后2，14 d时间点各随机处死3只大鼠，阴性对照组各处死2只大鼠,取心肌组织作快速冰冻切片，荧光显微镜下观察EGFP表达情况. 结果： 在荧光显微镜下观察EGFP表达情况，阴性对照组隐约可见淡绿色荧光，第2天各转染组均可见明显的绿色荧光分布于所取心脏组织. 各转染组荧光强度与阴性对照组相比,其差异均有统计学意义(P<0.05).心肌注射组和尾静脉注射组间荧光强度差异无统计学意义（P=0.17）. 冠状动脉灌注转染组荧光强度较其余两组增强7.37倍（P=0.013）. 第2周转染各组荧光强度明显减弱，与阴性对照组差异无统计学意义(P=0.41). 结论： 阳离子脂质体lipofectamine2000可有效的将质粒重组体通过各种方式转染心肌组织，而通过冠状动脉灌注转染可以明显提高其转染效率.

【关键词】  脂质体；心肌；转染；质粒；绿色荧光蛋白质类

     0引言

    　　基因为心血管疾病的治疗带来了新的希望［1］，如何高效、稳定、安全地将目的基因转染到心肌组织是基因治疗中的关键问题. 目前，外源基因导入哺乳动物细胞的方法大致有生物方法和物理化学方法2种. 前者主要以病毒为载体，外源基因在宿主细胞中能长期表达，属当前基因治疗中首选的基因转染方式，但其安全性差、缺乏靶向性等缺点使其应用受到很大限制. 后者包括磷酸钙法、显微注射、电穿孔等,因其操作方法限制，不适于大量细胞的转染及基因治疗的在体研究［2］. 阳离子脂质体是一种非病毒制剂，由于其具有转染效率相对较高、操作简易、可大规模转染及不引起特异性免疫反应等优点受到大家的关注. 本研究应用阳离子脂质体lipofectamine2000将质粒重组体通过局部心肌注射、尾静脉注射、冠状动脉灌注转染3种途径转染至心肌组织，并比较其转染效率，为今后进行心肌组织在体转染的研究提供方法学.

    1材料和方法

    1.1材料SD雄性大鼠22只，体质量 150～200 g,购自华中科技大学同济医学院实验动物中心. pGenesil?1质粒及感受态细胞DH5а购自武汉市晶赛生物工程技术有限公司，lipofectamineTM2000及OMEM培养基购自Invitrogen.

    1.2方法

    1.2.1pGenesil?1质粒重组体的构建质粒重组体pGenesil?1的构建参考［3］，本研究使用U6启动子指导目的基因编码序列的转录及PolⅢ识别的终止信号终止转录，其含有绿色荧光蛋白编码基因及相应的抗性基因.

    1.2.2质粒脂质体复合物的制备参考lipofectamine2000转染说明：将5μg pGenesil?1和10 μL lipofectamine2000分别稀释于OMEM中，总体积各为30 μL，室温静置5 min，将二者轻柔混合，孵育20 min，制成质粒脂质体复合物.

    1.2.3动物分组及模型建立22只雄性SD大鼠，随机分为4组：阴性对照组（Ⅰ组，n=4），心肌注射组（Ⅱ组,n=6），尾静脉注射组(Ⅲ组，n=6)，冠状动脉灌注转染组（Ⅳ组，n=6）. 第Ⅱ组大鼠用200 g/L（300 mg/kg, ip）乌拉坦联合10 g/L戊巴比妥(20 mg/kg, ip)复合麻醉，气管插管，呼吸机支持，于左胸第4肋间打开胸腔，充分暴露心脏并剥离心包，将30 μL质粒脂质体复合物多点斜行注射到大鼠左室前壁，关胸饲养.  第Ⅲ组大鼠将30 μL质粒脂质体复合物用900 μL OMEM稀释后经尾静脉快速（5 s内）注射完全部液体. 第Ⅳ组同第Ⅱ组麻醉大鼠，于第3肋间开胸，眼科镊撑开肋间，充分暴露心脏及升主动脉，将30 μL质粒脂质体复合物注射于心室，同时用自制无损伤血管钳于升主动脉根部稍远处阻断循环5 s，关胸饲养. Ⅱ～Ⅳ组于转染后2 d，2 wk时间点各随机处死3只大鼠，阴性对照组在上述时间各处死2只大鼠.

    1.2.4荧光显微镜观察大鼠心肌转染效率pGenesil?1质粒携带有U6启动子及增强型绿色荧光蛋白编码基因，成功转染后能在细胞内借助U6启动子转录并翻译出绿色荧光蛋白，我们可以通过荧光显微镜直接观察并评估质粒重组体的转染效率. 第Ⅱ组大鼠取出心脏将心尖处局部注射部位取出，其余组将心底部主动脉流出道附近心肌取出，放入冷冻包埋剂中，低温成型后，冰冻切片机连续切片，片厚10 μm，荧光显微镜下以蓝光激发EGFP绿色荧光，观察并摄片. 采用HMIAS?2000型全自动医学彩色图像分析系统分析各转染组和阴性对照组荧光的平均荧光强度，重复4次.

    统计学处理:用SPSS13.0统计软件对数据作处理, 数据以x±s表示，两个均数比较用t检验，多个均数比较用单因素方差分析. P<0.05为差异有统计学意义.

    2结果

    2．1各转染组EGFP在转染心肌的表达荧光显微镜下阴性对照组心肌可见微弱的自发荧光，转染2 d的大鼠心肌均表达明显增强的绿色荧光，其中冠状动脉灌注转染组荧光强度最强，荧光范围也最大，而以主动脉流出道位置荧光强度最强（图1）.

    2．2各转染组平均荧光强度比较采用HMIAS?2000型全自动医学彩色图像分析系统分析各转染组和阴性对照组的平均荧光强度可见，各转染组荧光强度较阴性对照组差异均有统计学意义(P<0.05)，其中冠状动脉平均荧光强度较其余两组增强7.37倍（P=0.013, 图2）.

    3讨论

    近年来基因治疗已经广泛用于临床心血管疾病的综合治疗过程中，其成功与否取决于外源基因能否转移到靶组织，并有效的适度表达，其中基因转染的载体和转染方式是关键因素.  阳离子脂质体是近年来倍受关注的非病毒转染载体，在脂质体的磷脂成分中加入带正电荷的磷脂分子，使其外部带正电荷，既有利于包裹DNA分子，又有利于和细胞膜接触,在细胞内，阳离子?DNA复合物发生分离而基因进一步被传递到细胞核，并进行转录、翻译，最终产生目的基因编码的蛋白［4］. 本研究所应用的质粒重组体携带有EGFP编码基因，其编码的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）是一种从水母中分离出来的能自体发光的蛋白质，它能够在紫外线的激发下发出明亮的绿色荧光. 人们对其特性和基因进行了深入的研究和改造，使GFP得以作为一种新的报告基因加以利用［5］. EGFP是一种突变型GFP，其产生的荧光较普通型增强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度［6］. EGFP与目的蛋白同时表达可借此观察目的基因在心肌组织中的表达情况.

    A：阴性对照组；B：心肌注射组；C：尾静脉注射组；D：冠状动脉灌注转染组；E：冠状动脉灌注转染组升主动脉.

    图1转染2 d时各转染组EGFP的表达×100

    A：阴性对照组；B：心肌注射组；C：尾静脉注射组；D：冠状动脉灌注转染组；aP<0.05 vs阴性对照组; bP<0.05 vs心肌注射组和尾静脉注射组.

    图2各转染组平均荧光强度比较

    最初基因的途径集中于局部注射于靶器官. 早在1990年，Wollf等［10］证实了将质粒DNA直接注射在心肌和骨骼肌，可获得外源基因的表达，从而开创了基因组织原位转染的先河. 活体角膜、脊髓等是脂质体介导的在体转染良好的靶器官，而关于脂质体介导下心肌组织在体转染的报道很少. 本研究证实经局部心肌注射质粒脂质体复合物可以使大鼠心肌组织表达外源基因，但其表达效率较其他两组并无优势，究起原因可能是因为局部注射可以引起注射部位附近心肌坏死及纤维化［8］，从而影响转染试剂向周围组织的弥散及心肌细胞对质粒脂质体复合物的吞饮吞噬作用，另一方面由于心肌组织的结构特性，导致局部注射只能仅仅局限在一个很小的范围，难以达到临床上治疗心肌组织系统疾病的目的，大大影响了基因治疗的效果. 尾静脉注射法也是近年来在体转染常用途径，可以使质粒DNA广泛分布于全身各个器官. 但这种方法会将大部分DNA压入肝脏，其他部位DNA含量较少，有人分析这种转染可能是由于大体积DNA溶液快速注射到大鼠体内后在心脏发生阻塞，溶液返回来后通过肝静脉进入肝脏所致［9］，也有人推测质粒的吸收是通过受体介导非特异吸收的途径进入细胞的，质粒与细胞表面的接触时间较长，从而影响了转染效率［10］. 本研究结果表明经冠状动脉转染质粒重组体，心肌组织转染效率较心肌注射组和尾静脉注射组明显增高. 由于大鼠直接冠状动脉转染难度较大，我们采用左心室腔注射，同时阻断主动脉5 s的方法实施冠状动脉灌注转染［11］，阻断循环使心室血流在收缩期不能进入体循环，舒张期时冠状动脉内压力增加，并且在此期间大鼠心率减慢，可以相应延长舒张期时间，大量血流可以经左右冠状动脉窦进入心肌微血管，如此反复多次，可以大大提高转染效率［12］，荧光图片也证实在升主动脉流出道位置转染效率最高. 从实践意义来讲，随着介入心脏病学的广泛开展，在做冠脉造影时可以完成基因治疗从而使冠状动脉内转染具有现实可行性.

    另外，在研究中我们还发现在转染2 wk后，3种转染途径的转染效率均明显下降，与对照组无明显差别，可能是因为脂质体介导的活体转染毕竟是一个瞬时转染的过程，随着时间推移，外源基因最终在体内经过循环被代谢，要达到有效的转染效率需要在整个过程中反复多次进行转染.

    综上所述，我们认为通过局部心肌注射、尾静脉注射、冠状动脉灌注转染3种途径均能有效的将外源DNA导入宿主细胞，相比之下冠状动脉灌注转染途径具有最高的转染效率，为下一步进行心肌组织的在体转染提供了方法学.

【参考】
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［3］ 郎明健，曾秋棠，郭敏, 等. 大鼠结缔组织生长因子短发夹RNA 干扰质粒重组体的构建和鉴定［J］. 临床心血管病杂志,2007,23(1):51-55.

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