pEGFP?C2?GATA4真核表达载体的构建及在P19细胞中的表达

             作者：张金平，王巍，张雷，王慧娟，赵春芳，陈炜，赵秀军

【摘要】  目的： 构建小鼠GATA4基因融合绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP?C2?GATA4，并检验其在P19细胞中的瞬时表达. 方法： 以真核表达质粒pEFSA?GATA4为模板，PCR扩增得到小鼠GATA4基因片段，将目的片段亚克隆到pEGFP?C2载体，卡那霉素筛选阳性克隆，经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定. 将重组质粒pEGFP?C2?GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞，用免疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GATA4在P19细胞中的表达. 结果： 酶切、测序结果表明将基因片段GATA4正确插入pEGFP?C2载体，并可在P19细胞中检测到GATA4基因和GATA4?EGFP融合蛋白表达. 结论： 成功构建真核表达质粒pEGFP?C2?GATA4，并在P19细胞瞬时表达成功，为进一步研究GATA4在心脏发育中的作用奠定了基础.

【关键词】  pEGFP?C2载体；GATA4；真核表达质粒；P19细胞；转染

     0引言

    　　GATA4是GATA锌指转录因子家族中的一员，具有结合核酸共同序列GATA的特性，是目前研究最多的与心脏发育密切相关的转录调控因子之一［1］. GATA4作为心脏前体细胞的最早标志之一，在调节心肌细胞的发生、分化以及心肌前体细胞形成线状心管等过程中发挥重要作用［2］. 为进一步研究转录因子GATA4在心脏发育及心肌分化中的作用，本研究构建了含有小鼠GATA4编码框的pEGFP?C2?GATA4真核表达载体，并在P19细胞中瞬时表达成功，为进一步研究心脏特异转录因子的功能及调控机制奠定了基础.

    1材料和方法

    1.1材料限制性内切酶EcoRI, XbaI和HindⅢ购自TaKaRa，转染试剂Lipofectamine2000和培养基α?MEM购自invitrogen公司，DNA回收试剂盒、T4 DNA连接酶、DNA marker购自宝生物公司，PCR试剂盒购自赛百盛公司，质粒抽提试剂盒购自Promega公司，pEFSA?GATA4质粒由日本Hiroshi AKAZAWA博士惠赠，pEGFP?C2载体、感受态菌株DH5α由本实验室保存. P19细胞系来源于武汉细胞库. 胎牛血清、胰蛋白酶、青链霉素、SP免疫组化即用型试剂盒、兔GATA4一抗（Santa公司）均购于博海生物公司.

    1.2方法

    1.2.1PCR扩增GATA4基因编码框以pEFSA?GATA4质粒为模板，上游引物：5′?GCCGGAATTCATGTACCAAAGCCTGGCCATGGC ?3′，引入酶切位点EcoRI；下游引物：5′?GCGCTCTAGATTACGCGGTGATTATGTCCCCATGA ?3′，引入酶切位点XbaI. 反应体系如下：10×Buffer(含MgCl2)2.5 μL，5 mmol/L dNTP 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，质粒模板DNA 0.5 μL，5 U/μL Ex?Taq酶0.2 μL，补水至25 μL，瞬时离心混匀，循环参数：95℃ 5 min，95℃  30 s，55℃ 30 s，72℃ 80 s，25个循环；72℃ 10   min. 反应完毕后，琼脂糖凝胶电泳，割胶回收靶片断，回收步骤参见宝生物溶胶回收试剂盒.

    1.2.2酶切和连接将上一步回收纯化的DNA和载体pEGFP?C2用XbaI和EcoRI限制性内切酶分别消化并再次回收. 酶切体系如下：Buffer M  5 μL, BSA  5 μL, 待切DNA  30 μL, XbaI  1 μL,补水至50 μL. 酶切条件：37℃，2 h,再加5 μL  Buffer H，混匀后加EcoRI   2 μL进行酶切，37℃，2 h. 回收后将二者连接，连接体系： Ligation Buffer 1 μL, T4 DNA连接酶1 μL, Gata4扩增后酶切并回收产物2 μL, pEGFP?C2酶切回收产物2 μL, 共10 μL，短暂离心混匀后，置16℃恒温过夜.

    1.2.3转化大肠杆菌、阳性克隆菌落PCR鉴定连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含抗生素Kana的LB培养基上，培养16～24 h，挑取多个阳性菌落,进行PCR鉴定，PCR反应体系、循环参数和引物同上.

    1.2.4重组质粒酶切及测序验证挑取阳性菌落，Promega质粒抽提试剂盒抽提重组质粒，经酶切鉴定，并送上海生工测序.

    1.2.5P19细胞的培养和质粒转染P19细胞生长培养基配制：α?MEM培养液含100 mL/L胎牛血清、青霉素1万U/L、链霉素100 mg/L，pH 7.2～7.4. 于50 mL /L CO2 ，37℃条件下培养，待贴壁后换液体，细胞长满后传代，之后每2 d传代1次. 取传代4次以上的细胞，按Lipofectamine 2000转染试剂操作步骤转染质粒.

    1.2.6GATA4基因和EGFP?GATA4融合蛋白的检测转染之后24 h，于激光共聚焦扫描显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达；常规免疫细胞化学法显示GATA4蛋白的表达情况，兔GATA4一抗1∶50稀释；提取细胞DNA，PCR检测GATA4的基因表达： GATA4上游引物: 5′? AAGACGCCAGCAGGTCCTGCTGGT ?3′；下游引物: 5′?CGCGGTGATTATGTCCCCATGACT ?3′；GAPDH上游引物: 5′? AGGTGAAGG TCGGAGTCAACG ?3′,下游引物: 5′?AGGGGTCATTGATGG CAACA ?3′, 反应体系如下：10×Buffer 1.5 μL，5 mmol/L dNTP 1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，提取DNA 0.5 μL，5 U/μL Ex?Taq酶0.2 μL，补水至12.5 μL.循环参数:94℃ 5 min，94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s, 35个循环，72℃ 10 min. PCR产物5 μL在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳 ；Western Blot检测GATA4融合蛋白表达情况：在转染24 h，加入全细胞蛋白裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，BCA法定量后,以20 μg/孔的上样量分别进行100 g/L SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后，50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，然后用相应抗体杂交，兔GATA4一抗1∶100稀释，ECL显色.

    2结果

    2.1目的片段的扩增以pEFSA?GATA4质粒为模板，扩增出约1400 bp的基因片段，与小鼠GATA4基因编码框（1325   bp）大小一致（图1）.

    1: GATA4扩增产物; M: DL2000  marker.

    图1PCR扩增GATA4基因

    2.2酶切PCR产物及克隆用载体的回收分别得到带有EcoRI和XbaI酶切位点的基因片段（约1400 bp）和载体（4.7 kb）（图2）.

    1: EcoRI /XbaI双酶切pEGFP?C2; M: DL15 000 marker; 2: EcoRI/XbaI双酶切GATA4.

    图2酶切pEGFP?C2载体和GATA4基因

    2.3菌落PCR及酶切和测序鉴定菌落PCR显示从重组质粒中可扩增出大小约1400 bp的目的条带（图3），所提质粒经HindIII+XbaI双酶切之后，可获得约1400 bp和4.7 kb的条带，XbaI单酶切可得到约6 kb的片段（图4）. 用启动子CMV引物进行测序，测序结果证实已将GATA4基因编码框正确插入pEGFP?C2载体的多克隆位点（MCS）. 确定在本研究中，pEGFP?C2?GATA4重组质粒构建成功.

    M: DNA Marker DL2000; 1~5: 重组质粒菌落PCR 产物; 6: 空载体对照.

    图3菌落PCR

    1,3: pEGFP?C2?GATA4; 2: HindIII+XbaI 双酶切pEGFP?C2?GATA4; 4: XbaI单酶切pEGFP?C2?GATA4; 5: 空载体; M1: DL15000 Marker; M2: DL2000 Marker.

    图4pEGFP?C2?GATA4酶切鉴定

    2.4pEGFP?C2?GATA4重组质粒在P19细胞中的表达　　转染之后24 h，于共聚焦扫描显微镜下可见部分P19细胞表达EGFP?GATA4融合绿色荧光蛋白，该蛋白在细胞核和细胞质内均有表达，呈强绿色荧光（图5）；免疫细胞化学结果显示GATA4蛋白在P19细胞的细胞质和核中都可有表达，DAB显色呈棕黄色（图6）；PCR结果显示在P19细胞的DNA中，没有扩增出阳性产物，而在转染pEGFP?C2?GATA4的P19细胞中，可扩增出目的条带（图7）；Western Blot结果显示在正常P19细胞，没有出现约72 ku(GATA4融合EGFP蛋白45 ku+27 ku)大小左右的条带，而在转染pEGFP?C2?GATA4的细胞组中，出现72 ku大小左右的条带（图8）. 说明质粒pEGFP?C2?GATA4可在P19细胞中瞬时表达.

    3讨论

    　　GATA转录因子基因家族具有与特定DNA结合A：荧光激发视野；B：普通视野.的锌指结构域,在进化过程中高度保守. 该家族转录因子GATA4虽在中胚层和内胚层起源的组织中如心脏、性腺、肺、肝及小肠中均有广泛表达，但它也是心脏形成中一个关键的转录因子,并在心脏发育中起重要作用，人GATA4基因定位于8p23.1, 小鼠GATA4基因定位于14号染色体，cDNA全长3393 bp,编码框1325 bp,有6个外显子,编码441个氨基酸［3-4］. GATA?4通过与其他转录因子如肌细胞增强因子2（MEF?2）、血浆应答因子(SRF)、NKX2?5等的相互作用,调控心肌中特异的一些基因如α?肌球蛋白重链(α?MHC)、肌球蛋白轻链1/3(MLC1/3)、肌钙蛋白C、心房利钠肽(ANF)等的表达来调节心脏发育［5］. GATA?4突变和缺失可引起心血管发育的异常，且动物胚胎因心脏的结构缺陷多在胚胎的8~13 d死亡，GATA4对心肌细胞的正常存活也有一定的作用,能够阻止药物诱导的心肌细胞凋亡发生和降低药物引起的心毒性［6-7］.  国内外众多研究者都致力于GATA4在心脏发育、心肌分化中的确切机制的研究，因此一个高表达、合适的真核载体对研究其在心肌分化、心脏发育中的作用是非常有利的.

    pEGFP?C2载体具有易转染真核细胞的特点，且以EGFP为报告基因的表达载体具有检测方便、荧光稳定、对宿主细胞无任何毒害、不影响目的蛋白的生物活性等优点［8］. 目前国内尚没有发现将GATA4基因克隆进pEGFP?C2载体的报道，因此本实验构建了真核表达载体pEGFP?C2?GATA4. 载体pEGFP?C2中的启动子CMV (巨细胞病毒)和加尾信号SV40 poly是两个高效的转录调控元件，将GATA4插入到pEGFP? C2的多克隆位点中，即将GATA?4克隆到启动子CMV和加尾信号SV40 poly 间的EGFP基因C末端,并与其融合,以确保将GATA4在宿主细胞内的有效表达及其产物特定调节功能的发挥. 该载体含有neo (新霉素)抗性基因,可用于真核表达筛选，是一个可在哺乳动物细胞中高效表达的载体.

    实验证实pEGFP?C2?GATA4可在P19细胞中瞬时表达，因此，该质粒的构建可为研究GATA4在心脏发育、心肌分化中的作用、调控机制以及研究GATA4与其他转录因子相互之间的协同作用提供实验基础.

【】
  ［1］Grépin C, Nemer G, Nemer M. Enhanced cardiogenesis in embryonic stem cells overexpressing the GATA?4 transcription factor［J］. Development, 1997,124(12): 2387-2395.

［2］ Molkentin JD, Lin Q, Duncan SA, et al. Requirement of the transcription factor GATA4 for heart tube formation and ventral morphogenesis［J］. Genes Dev, 1997,11(8):1061-1072.

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［4］张文，田杰，朱静. 转录因子GATA?4与心脏发育［J］. 国外医学·儿分册，2004,31(1):45-47.

［5］ Temsah R, Nemer M. GATA factors and transcriptional regulation of cardiac natriuretic peptide genes［J］. Regul Pept, 2005,128(3):177-185.

［6］ Xin M, Davis CA, Molkentin JD, et al. A threshold of GATA4 and GATA6 expression is required for cardiovascular development［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006,103(30):11189-11194.

［7］ Aries A, Paradis P, Lefebvre C, et al. Essential role of GATA?4 in cell survival and drug?induced cardiotoxicity［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(18):6975-6980.

［8］ Waido GS, Standish BM, Berendzen J, et al. Rapid protein?folding assay using green fluorescent protein［J］. Nat Biotechnol, 1999, 17(7):691-695.