姜黄素酯化物抗平滑肌细胞增殖和调血脂作用研究
作者：黄燕芬 洪行球 袁小凤
【摘要】 ［目的］ 研究姜黄素酯化物对不同条件促牛主动脉平滑肌细胞（VSMC）增殖作用和对小鼠食饵性高脂血症的影响，初步探讨其构效关系。［方法］ 用丁二酸酐酯化姜黄素获得姜黄素酯化物；用oX-LDL或血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）培养牛VSMC建立VSMC增殖模型，再在模型中加姜黄素和姜黄素酯化物培养，用 MTT法检测观察二者对平滑肌细胞（VSMC）增殖作用的影响；用高脂膳食喂饲小鼠建立食饵性高脂血症模型，用姜黄素和姜黄素酯化物进行实验性，给药2周后处死小鼠，测定血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和高密度脂蛋白（HDL?C）含量，低密度脂蛋白（LDL?C）含量，观察其调血脂作用。结果 姜黄素酯化物浓度在 66μmol/L、33μmol/L、16.5μmol/L时，对10 mg/L oX-LDL培养的VSMC增殖有明显的抑制作用，P＜0.05；剂量在0.3mmol/（kg·d）时，可降低食饵性高脂血症小鼠血清TG含量P＜0.05，但降TC、LDL?C和上调HDL作用不明显。［结论］姜黄素酯化物高剂量时能明显抑制oX-LDL和Ang Ⅱ促牛VSMC 增殖作用；能明显降低血清TG降低食饵性高脂血症小鼠血清TG含量。
【关键词】 姜黄素 酯化物 平滑肌细胞 调血脂
Abstract：［Objective］To study the effects of the anti?proliferation of ramifications of the curcumin esterified by succinic anhydride on the Bovine VSMC and regulating the lipids in hyperlipidemic mice induced by high lipid diet to study the relation between structure and effect.［Methods］Curcumin was esterified by succinic anhydride，MTT was used to observe the anti?proliferation of the ramifications of the curcumin esterified by succinic anhydride on VSMC stimulated by ox?LDL.Mice were fed with high lipid diet 1 week to be hyperlipidemic model,and then given experimental treatment with curcumin and ramification of curcumin.The level of total cholesterol（TC） and triglyceride（TG）and HDL?C in serum were all measured in 15 days.The level of LDL?C was caculated.［Results］ The ramification of the curcumin esterified（66μmol/L）has obvious effect on the inhibition of VSMC stimulated by 10 mg/L ox?LDL（P<0.05）；And it has effects on decreasing the level of TG in serum of the mice induced by high lipid diet.［Conclusion］ The results indicate that ramification of curcumin esterified by succinic anhydride has obvious effect on inhibition of VSMC stimulated by 10 mg/L ox?LDL and 2 mg/L Ang Ⅱ.It has significant effects on decreasing TG in serum.
Key words： ramification of curcumin esterified by succinic anhydride；smooth muscle cell；regulating the concentrations of lipids
姜黄素是中药姜黄中的一种酚性色素，具有调血脂、抗氧化、抗肿瘤等广泛的药理作用［1?4］。但其水溶性较小、生物利用度不高，引起了学者的关注，探讨解决的途径主要集中在药剂学方面。从化学结构分析，姜黄素有二个如同肉桂醛的苯丙烯酰基骨架，两个苯环上各有一个酚羟基和一个甲氧基，丙稀基与一个β?双酮/烯醇式结构连接。它的两个天然衍生物一脱甲氧基和二脱甲氧基姜黄素已报道有抑制平滑肌细胞、内皮细胞增殖，促进低密度脂蛋白受体表达，有降血脂、抗脂质过氧化和上调脂代谢相关酶类的活性作用［5?8］，在此基础上，笔者利用姜黄素母核中具有两个酚羟基，通过二分子丁二酸酐酯化，得到一个含二分子甲氧基、二分子羧基姜黄素酯化物（以下简称REC）；观察它对牛VSMC 增殖和小鼠食饵性高脂血症的影响，初步探讨其构效关系。
1 材料与方法
1.1 姜黄素酯化物（REC）的制备
取纯度大于98%的姜黄素，加NaOH制成钠盐，溶解于无水吡啶，滴加于在室温下搅拌的无水丁二酸酐吡啶溶液中，反应结束后，取样薄层色谱用氯仿∶甲醇∶甲酸（93∶7∶0.7）展开，柱色谱分离得到姜黄素酯化物。以药品生物制品检定所,提供的姜黄素（批号823?9401）为对照品，利用姜黄素母核有β二酮基，可与硼酸在无水酸性条件下呈红色的原理，显色法测得纯度为92.2％。
1.2 牛VSMC培养
采用组织块法培养牛VSMC。无菌条件下取新生小牛主动脉，分离中膜平滑肌层，剪碎贴块培养，培养液为含20％小牛血清的RPMI1640培养液，待细胞长满瓶底后，按常规方法用含10％小牛血清的RPMI1640培养液传代培养，取3～6代细胞用于实验。
1.3 ox?LDL的制备
取新鲜人血浆，经密度梯度超速离心、Sepharose 6B凝胶过滤，得LDL，用铜离子氧化法氧化，Folin?lowry法测定蛋白含量，抽滤除菌，4 ℃保存［7］。
1.4 REC对ox?LDL促牛VSMC增殖的作用
取生长良好的VSMC以104～105/ml接种于96孔培养板，每孔100 μl，37 ℃、5％ CO2孵育24h，待细胞贴壁后更换无血清培养液继续培养24 h，使大多数细胞同步于G1/G0期后， 随机分3组：正常对照组为含5％小牛血清RPMI1640培养液100μl；ox?LDL组为上述等量培养液中加ox?LDL至终含量为10 mg/L；药物组为在ox?LDL组基础上，加姜黄素及REC各至终浓度分别为16.5，33，66 μmol/L。37℃、5％CO2继续培养48 h后，将原培养液吸净，每孔加入0.5 mg/ml的MTT 100 μl，继续孵育4 h，弃MTT液后每孔加DMSO 100 μl充分溶解深蓝色结晶，于酶标仪上570 nm测消光系数。计算其对ox?LDL促牛VSMC增殖的抑制率，抑制率＝（试验组吸光度－模型对照组吸光度）/模型对照组吸光度×100％
1.5 食饵性高脂血症小鼠模型的建立与分组
取浙江中医药大学实验动物中心提供的清洁级昆明种小鼠40只♀♂各半，体重18～20g，每笼5只，饲养温度23±1℃，湿度40%～70%。适应性饲养3d后，随机分出10只为正常对照组，给予基础饲料喂养（稃皮粉25%，豆粉15%，鱼粉10%，玉米粉20%，4号粉25%，食盐1%，鱼肝油1%，其他3%）；余下喂饲高脂饲料（胆固醇2%，猪油10%，胆酸盐0.25%，蛋黄粉10％，基础饲料77.75%），自由进食，1周后，在继续喂饲高脂饲料同时，模型组给予20ml/（kg·d）1%羧甲基纤维素灌胃，药物组给予0.3mmol/（kg·d）姜黄素和REC组用20ml/（kg·d ）1%羧甲基纤维素溶液调匀后灌胃，正常组每天灌服与模型组相同溶液。给药15d后处死动物，处死前一天晚上8时撤去饲料，第二天上午取血，血清用于测定TC、TG和HDL。
1.6 测定方法
血清TC、TG用酶法测定，HDL?C用磷钨酸?镁沉淀法去LDL和VLDL后，上层再用酶法测定，试剂盒由宁波慈城生化试剂厂生产，LDL?C含量按公式LDL?C=TC?HDL?C?1/5TG。
2 结果
2.1 REC对ox?LDL促牛VSMC增殖作用
实验可见，10μmol/L的ox?LDL有明显的促牛VSMC增殖作用，P＜0.05； 姜黄素高、中、低剂量组，均有明显的抑制ox?LDL促牛VSMC增殖作用,P＜0.05；REC高、中、低剂量组有明显的抑制ox?LDL促牛VSMC增殖作用，P＜0.05；结果见表1。表1 姜黄素酯化物对ox?LDL促牛VSMC增殖作用（略）
2.2 REC对小鼠血清TC、TG、HDL?C、LDL?C含量作用
实验结果显示，姜黄素能降低血清TC、TG、LDL?C和上调HDL?C，P＜0.05；姜黄素有调节血脂作用，姜黄素酯化物能明显降低TG，P＜0.05。结果见表2。表2 姜黄素酯化物对食饵性高脂血症小鼠血清脂质的影响（略）
3 讨论
根据药研究，姜黄素具有广泛的药理作用，而且不良反应小，很早就被世界各国关注。但姜黄素口服吸收率低、水溶性小、稳定性差、生物半衰期短、血药浓度低、生物利用度不高，为解决这些问题，有学者正在进行一些有针对性的研究，其中包括①寻找合适的载体，以增加姜黄素的水溶性和口服吸收率，延缓生物半衰期，如用聚乙二醇连接姜黄素②改变剂型和给药途径，如将姜黄素制备成水包油乳剂，供注射给药等。
为解决姜黄素水溶性小这一问题，本实验从药物化学角度入手通过对姜黄素母核上取代基的修饰来探讨这个问题。利用姜黄素分子中具有两个酚羟基结构，通过二分子丁二酸酐酯化，得到含二个甲氧基、二个羧基姜黄素酯化物；观察了姜黄素酯化物对VSMC 增殖和小鼠食饵性高脂血症的影响，初步探讨其构效关系。
姜黄素经丁二酸酐酯化后从理论上讲极性增大，实验结果我们得到一个小于二脱甲氧基姜黄素的黄色斑点，说明极性基团比姜黄素强；斑点在无水酸性环境中加硼酸呈红色，说明姜黄素基本母核没有被破坏，经推理应为姜黄素的一酚羟基酯化和二酚羟基酯化产物。进一步的结构分析，有待通过波谱分析来验证。
与姜黄素一样姜黄素酯化物高中低剂量均能能明显抑制ox?LDL促牛VSMC 增殖作用，说明就这点上我们改变了其极性，而没有改变其作用，这正是我们的目的之一，姜黄素酯化物高剂量时能明显降低血清TG，但 降TC、LDL?C和上调HDL作用不如姜黄素明显。这是否与姜黄素结构酚羟基被酯化有关有待进一步研究。
【】
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