中药对去势大鼠神经内分泌免疫网络的影响
【摘要】 ［目的］从神经-内分泌-免疫（RNEI-N）角度探讨补肾活血中药复方益妇宁软胶囊（YFN）改善更年期综合征（CS）的作用机制。［方法］采用大鼠去势复制CS动物模型，给药4周后，测定大鼠血清E2、FSH、LH、Te、P、IL?2及下丘脑、垂体和血浆β?EP水平；测定下丘脑5?HT、5? 5?HIAA、NE及DA含量；检测子宫、脾脏和主动脉雌激素受体（ER）水平。［结果］YFN能升高去势大鼠血清E2、IL?2水平，提高子宫、脾脏和主动脉ER水平，升高下丘脑、垂体和血浆β?EP水平，降低下丘脑5?HT和5?HIAA水平，升高NE和DA的含量，降低5?HT/NE、5?HT/DA的比值。［结论］YFN通过调节生殖内分泌功能，改善植物神经功能紊乱，提高机体ER水平和免疫功能，能从多层次、多途径、多环节作用于更年期衰退的神经内分泌免疫网络，从而达到稳定机体内环境，缓解CS症状的作用。
【关键词】 更年期综合征 去势大鼠 中药 神经 内分泌 免疫网络
Abstract: ［Objective］To explore the therapeutic mechanisms of traditional Chinese medicine formula Yifuning soft capsules（YFN）which can nourish the kidney and activate blood on treating climacteric syndrome（CS）from neuroendocrine? immune network（NEI?N）.［Method］We established the models of climacteric syndrome with ovariectomized（OVX）rats. After giving drugs 4 weeks，we detected serum sex hormone（E2，P，Te，FSH，LH），interleukin?2（IL?2）and hypothalamic，pituitary and plasma β?endorphin（β?EP）levels. The hypothalamic monoamine transmitters （NE，DA，5?HT，5?HIAA）contents were detected. The estrogen receptor（ER）levels of uterus，spleen and artery were detected too. ［Result］YFN can improve levels of serum E2，IL?2 and ER of uterus，spleen and artery in OVX rats. YFN can increase reduced hypothalamic，pituitary and plasma β?EP levels in OVX rats. YFN can reduce contents of hypothalamic 5?HT and 5?HIAA，increase the levels of NE and DA in OVX rats and reduce the ratio of 5?HT to NE and 5?HT to DA in OVX rats. ［Conclusion］YFN may produce effects on declined NEI?N in menopause from various levels，ways and links by means of regulating the function of plant nerve and reproduction endocrine and improving levels of ER and body immunity. So they can stabilize inner condition of body and relieve the syndrome of CS.
Key words: Climacteric syndrome；Ovariectomized rats；Traditional Chinese Medcine；Neuroendocrine?immune network
神经?内分泌?免疫网络（NEI?N）与更年期综合征（Climacteric syndrome，CS）病理诸环节的关系十分密切，NEI?N学说的提出，对认识CS发病及防治提供了新的思路。补肾活血中药复方益妇宁软胶囊（YFN）是CS经验方，临床疗效确切［1］。本文建立CS大鼠模型，进一步从NEI?N角度探讨YFN改善CS的作用机制，为其临床应用提供客观依据。
1 材料
1.1 实验动物
SD雌性大鼠，体重190～220g，南方医科大学（原第一军医大学）动物实验中心提供。
1.2 受试药品
YFN由南方医科大学中医系中药新药研究室提供，批号：20020608。已烯雌酚片（Diethylstilbestrol Tablets，DT），广东药学院制药厂生产，批号：20000309。
1.3 主要试剂
雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、促黄体生成素（LH）、睾酮（T）及孕酮（P）放免试剂盒，拉尔文生物工程技术有限公司；白细胞介素?2（IL?2）放免试剂盒，北京邦定生物技术有限公司；β?EP放免试剂盒，上海第二军医大学神经生物学教研室；5?羟色胺（5?HT）、5?羟吲哚乙酸（5?HIAA）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）标准品，sigma公司；3H?雌二醇，放射比活性2.22TBq/mmol，New English Nuclear公司；17?β雌二醇，Sigma公司。
1.4 主要仪器
SN?682型放免γ计数器，上海核福光电仪器有限公司；RF?5000荧光分光光度计，日本岛津公司；LS6500液体闪烁计数仪，Beckman公司；754型紫外可见光分光光度计，上海第三分析仪器厂。
2 方法
2.1 动物模型与分组
大鼠麻醉后，摘除两侧卵巢，通过去势制作CS大鼠模型。随机分为4组：正常对照组（手术暴露卵巢但不切除）、模型对照组、DT片、中药组，每组各10只。DT片用蒸馏水配成0.02g·L-1溶液；益妇宁软胶囊用1%吐温80配成混悬液，每毫升混悬液相当于原生药250mg。去势手术后9d始，用药各组按0.005ml·g-1灌服相应药液，连续4w。对照组灌服等容积生理盐水。
2.2 观察指标和测定方法
2.2.1 生殖内分泌激素和IL?2测定
末次灌胃并禁食12h后，大鼠断头，取躯干血，分离血清，-20℃保存，用放免法测定E2，LH，FSH，T，P和IL?2含量。另外，取3ml全血加入含有抗凝剂和抑肽酶的塑料试管中，混匀，离心，取上清，顺序饱和加样程序测定血浆β?EP递质含量。
2.2.2 下丘脑神经递质测定
动物断头取脑后，部分取下丘脑第三脑室周围组织，称重，荧光分光光度法测定NE，DA，5?HT及5?HIAA含量。部分动物全脑，煮沸后分离所需下丘脑与垂体前后叶，称重后加入酸匀浆后，取上清，平衡饱和加样程序测定垂体、下丘脑β?EP递质含量。
2.2.3 子宫及主动脉ER测定
子宫、主动脉和脾脏精确称重后，液氮冻存，放射配体结合分析法（HAP）测定ER。
2.3 统计学方法
统计方法为方差分析，结果采用SPSS10.0统计软件包处理。
3 结果
3.1 生殖内分泌激素
如图1所示，与正常对照组相比，去势后大鼠血清E2水平明显降低（P<0.01）；FSH、LH水平明显升高（P<0.01或P<0.05）；Te、P水平明显降低（P<0.01或P<0.05）。中药组对去势大鼠E2、FSH、P水平均有显著提高作用（P<0.01或P<0.05）。
3.2 下丘脑神经递质
由图2、3可知，模型对照组与正常对照组相比，5?HT、5?HIAA的含量均明显升高（P<0.01或P<0.05），DA含量降低（P<0.05），NE含量略有降低，但无统计学意义；去势大鼠下丘脑5?HT/NE、5?HT/DA水平明显升高（P<0.01）。中药组对去势大鼠升高的5?HT、5?HIAA的含量和5?HT/DA、5?HIAA/5?HT比例均有显著性地降低作用（P<0.01或P<0.05），对降低的NE、DA水平有显著提高作用（P<0.01或P<0.05）。
3.3 β?EP神经递质
由图4可知，与正常对照组相比，去势组大鼠下丘脑、垂体、血浆β?EP的含量均明显降低（P<0.01或P<0.05）。中药后，对大鼠去势后降低的β?EP的含量有显著的提高作用（P<0.01或P<0.05）。
3.4 各组大鼠血清IL?2和ER变化
大鼠去势后血清IL?2含量较正常对照组明显减少（P<0.05）；子宫、脾脏和主动脉ER含量较正常对照组大鼠均明显降低（P<0.01）。结果见图5。中药治疗后，对大鼠去势后降低的上述指标均有提高作用（P<0.01）。
3 讨论
妇女进入更年期，卵巢功能逐渐消退，卵巢的内分泌功能下降。雌孕激素水平明显降低，卵泡对促性腺素作用的反应较差，垂体分泌较多的促性腺激素达到排卵的需要，因此，CS首先存在内分泌激素的变化。本研究中，大鼠去势后，E2明显降低，FSH、LH值升高，符合妇女更年期时生殖内分泌变化情况。1994年Adashi［3］提出更年期中枢β?EP水平低落，对儿茶酚胺系统紧张性抑制作用减弱而出现一系列精神和植物神经系统功能紊乱。Ortega等报道给围绝经期妇女生理剂量的E2和孕激素（P）替代治疗后β?EP水平明显升高，情绪改善，症状缓解。血浆雌激素可强烈的抑制MAO的活性，更年期妇女山于雌激素水平下降，MAO活性因而上升，导致NE与DA由于分解（灭活）过多而含量减低［4］。Timiras［5］认为下丘脑CA，尤其是NE不论活性和含量都明显降低，这些改变可能与卵巢功能的下降有直接关系，甚至是大多数动物卵巢停止功能的原因。陈亚琼［6］认为，更年期综合征患者潮热、出汗及更年期综合征症状评分指数均与L?色氨酸、5?羟色氨酸及5?HT呈正相关关系。叶雪清［2］认为5?HT/DA、5?HT/NE的比例改变，可影响GnRH（促性腺激素释放激素）的释放量，继发GTH下降和卵巢功能衰退，是性腺轴系统老化的始动因素。本实验也表明大鼠去势后，下丘脑、垂体和血浆β?EP水平明显降低。去势大鼠下丘脑NE和DA水平较正常组下降；5?HT和5?HIAA的含量却随去势而增加。由于下丘脑内5?HT代谢及神经活性相应增强，而CA能神经活性减弱，从而使5?HT/NE、5?HT/DA的比值上升。
妇女进入更年期，免疫系统逐渐衰退，其中突出的是对免疫调节起重要作用的细胞因子IL?2活性明显下降。研究表明淋巴细胞产生IL?2的水平随年龄增加而下降，老龄动物体内的IL?2仅为年轻动物的5％［7］。CS患者与健康育龄妇女相比，血清IL?2水平及活性明显降低［8］。本实验中大鼠去势后，血清IL?2水平明显降低。
当雌激素减少时，这些组织和器官就会发生退行性变或代谢上的变化，ER数量、亲和力和结合力降低，可直接影响靶组织和器官的功能变化，产生一系列症状。研究发现，CS患者外周血白细胞ER含量明显降低，使机体免疫力低下，而血管中ER数目减少是绝经前女性冠心病易患因素之一。实验中去势大鼠子宫、主动脉和脾脏ER含量均显著降低。
综上所述，模拟CS的去势大鼠内分泌激素、神经递质、免疫功能及ER均出现不同程度的改变，提示CS的发病与NEI?N诸环节有密切联系。补肾活血中药复方益妇宁软胶囊（YFN）治疗后，去势大鼠血清E2、FSH、P水平显著提高；下丘脑、垂体和血浆降低的β?EP的含量显著升高，下丘脑5?HT、5?HIAA水平明显降低，NE、DA含量显著升高，从而使5?HT/NE、5?HT/DA水平降低；同时增强IL?2活性，升高子宫、主动脉、脾脏ER水平。因此，中药复方YFN可以调节去势大鼠生殖内分泌激素的紊乱，改善单胺及肽类神经递质的紊乱，增强免疫力，提高机体ER水平，增强E?ER生物学效应，从多环节、多层次、多途径作用于更年期失去平衡的NEI?N。提示YFN可能通过调整NEI?N的功能发挥药效，改善CS的各种症状。
【】
［1］刘晓伟，邓虹珠.益妇宁治疗更年期综合征65例临床观察［J］.中医药科技，2002，9（6）：353.
［2］叶雪清.围绝经期神经内分泌免疫的变化［J］.实用妇产科杂志，1993，13（2）：59.
［3］Adashi EY. The climacteric ovary as a functional gonadotropin?driven androgen?producing gland［J］. Fertil Steril，1994，62（1）：20?7.
［4］叶雪清.更年期综合征－神经内分泌免疫网络的变化［M］.西安：陕西技术出版社，1996：171，57，320.
［5］Timiras PS. Neuroendocrinology of Aging. New York：Plenum,1983：15.
［6］陈亚琼.血浆吲哚类神经递质与更年期综合征症状的相关分析［J］.中华妇产科杂志，1996，31（1）：41.
［7］段震峰.老年人白细胞介素2及其受体的研究［J］.中华老年医学杂志，1993，12（3）：165?167.
［8］张雅萍.坤宁安丸对更年期综合征患者生殖内分泌?免疫功能的影响［J］.中医药信息，2001，18（3）：52?54.
