HBV感染胎盘滋养细胞的体外研究

          作者：陈天艳，陈云茹，刘敏，牛迎花，蔺淑梅，叶峰，张曦，刘锦锋，赵英仁，张树林  

【摘要】  　　目的： 对早孕绒毛的滋养细胞进行原代培养，利用HBV感染血清对滋养细胞进行体外感染，探讨细胞在体外培养条件下对HBV的感染率及HBV在细胞中的复制状态. 方法： 利用胰蛋白酶和胶原酶联合消化培养法原代培养早孕胎盘中的滋养细胞，并进行免疫组化鉴定，获得纯度较高的滋养细胞后进行体外的HBV感染，通过细胞免疫化学染色、ELISA及PCR法分别检测细胞上清中的HBsAg，细胞中的HBV DNA及cccDNA. 结果： 原代培养的滋养细胞，细胞生长良好，特异性角蛋白?7阳性，纯度高. 原代滋养细胞在与HBV阳性血清共同孵育后均未出现明显的细胞病变，感染后24 h和48 h在滋养层细胞细胞浆中可见HBsAg的阳性表达，被感染细胞呈散在分布. 感染后48 h起可检测到弱阳性的HBsAg及HBVDNA，感染后细胞内未检测出cccDNA. 结论： 利用联合酶消化法建立了胎盘中滋养细胞的体外培养系统. HBV能够在体外感染原代培养的滋养细胞，对被感染细胞的生长无明显影响. HBV可能不在滋养细胞中复制.

【关键词】  乙型肝炎病毒；滋养层细胞；原代细胞培养

    【Abstract】AIM:  To set up the primary culture model of trophoblastic cells from human placenta and  to  investigate the infection ratio and replication of trophoblastic cells co?cultured  with HBV infection serum. METHODS: Using trypsin and collagenase associated digestion, trophoblastic cells were obtained from human placenta.  Immunohistochemistry staining of the cells were done for  identification of primary culture cells by specific anti?cytokeratin 7. Trophoblast cells were co?cultured with HBV infection serum for  24 h. The infection efficiency was  examined by ELISA of culture supernatants, immunohistochemistry of cell slides and  PCR amplification for HBV DNA and cccDNA of infected cells. RESULTS: The primary culture model of trophoblastic cells from human placenta was established successfully. Observation of the morphology of trophoblastic cells showed that no significant cytopathic effect was found when co?cultured with HBV. No significant destruction of cellular structure or cell?cell junction was found. Culture medium was collected at 24, 48  hours after infection, respectively. Secretion of HBsAg was observed at  48 hours post?infection. Both membrane and cytoplasmic localization of HBsAg were observed. The infected cells were in a  diffused distribution. The frequency of HBsAg positive cells at different time points did not show any significant changes. HBV infected cells had  very light specific band of HBV DNA and  no cccDNA was observed. CONCLUSION:  We establish a primary culture model of trophoblast cells. Our study indicates that trophoblastic cells cultured in vitro can be infected by HBV. But the efficacy of infection is low. The replication of HBV in trophoblastic cells is not observed.

    【Keywords】hepatitis B virus; trophoblastic cells; primary culture

　　0引言

    　　HBV母婴垂直传播可发生于宫内、产程和产后［1］. 随着我国将乙肝疫苗纳入计划免疫，宫内感染逐渐成为乙肝免疫失败的重要原因，阻断宫内感染将是控制我国乙肝流行和预防HBV相关疾病的关键. 胎盘被认为是宫内感染最主要的途径［2］. 胎盘是母体与胎儿之间的物质交换的桥梁，在HBV母婴传播中，它不仅是一个物理屏障，也构成了HBV宫内感染胎儿的通道. 由于胎盘屏障的第一层细胞是滋养层细胞，该层细胞直接与母亲血液接触，因此，HBV宫内感染的实现必须建立在HBV成功跨越胎盘屏障滋养层细胞的基础上. 既往研究［3］显示HBV可感染胎盘组织中的各类细胞，但大多是临床病理结果，体外研究很少. 建立在滋养层细胞来源的肿瘤细胞系中的研究固然方便，但在其实验结果的解释上及其适用性方面逊于原代培养细胞. 本研究利用消化法培养原代胎盘滋养层细胞，建立胎盘细胞的体外培养系统. 利用HBV感染血清进行体外感染，探讨体外培养条件下对HBV的感染率及病毒在细胞中的复制状况，为进一步的研究奠定基础，为控制HBV宫内胎盘感染提供新的线索.

    1材料和方法

    1.1材料DMEM（高糖型）培养基（含有HEPES和L?谷氨酰胺）和胎牛血清(美国Hyclone 公司)；胰蛋白酶和胶原酶I （美国Sigma公司）；抗角蛋白?7 IgG，波形蛋白IgG，鼠抗人HBsAg mAb，HBVM  ELISA试剂盒，羊抗小鼠链霉亲和素?过氧化物酶免疫组化试剂盒(北京中杉科技有限公司)；青、链霉素（宝生物大连有限公司）. HBV DNA 及cccDNA PCR引物由上海生物工程公司合成，6~10 wk人工流产胎盘绒毛组织由我院妇产科门诊手术室提供.

    1.2方法

    1.2.1滋养细胞的分离培养将新鲜绒毛组织置于无菌培养皿中，用0.01 mol/L PBS液（含青霉素500 U/mL，链霉素500 U/mL）冲洗数遍，去除血污，剪去膜状物、肉眼可见的血管，将绒毛剪碎至约1 mm3大小，似糊状，放入15 mL离心管中 加入2倍体积的胰蛋白酶（终浓度1.25 g/L）与胶原酶I混合液胶原酶I(终浓度1 g/L），用吸管吹打均匀后于4℃冰箱过夜 第2日取出，放入37℃水浴箱中，消化15 min后，小心移去上清液，加入相同体积胰蛋白酶(终浓度2.5 g/L)与胶原酶I混合液（终浓度0.4 g/L），混匀，37℃水浴箱中消化15 min. 消化后立即以等体积100 g/L FCS DMEM中和，以吸管轻轻吹打绒毛组织，使组织分解，经200目不锈钢滤网过滤，去除残余未消化组织，收集滤液. 滤液于15 mL无菌离心管中，1000 r/min，离心5 min, 弃上清，沉淀用含有双抗的无血清DMEM清洗两遍. 用无血清的DMEM重悬细胞，调整细胞数为8×106/mL，将细胞接种于1号培养瓶内，37℃  50mL/L CO2培养箱培养10 min，镜下观察，见部分细胞贴壁，稍加振荡也不浮起时，收集附壁未牢的细胞，接种于2号培养瓶内，37℃再静止10 min，轻轻晃动，再将未贴壁细胞悬液移入离心管中，1000 r/min离心5 min，用含200 mL/L胎牛血清培养液重悬细胞，37℃，50 mL/L  CO2孵箱培养. 接种24 h后更换培养液，每隔3~4 d换培养液1次，每日观察细胞，在倒置显微镜下直接观察细胞形态和生长状态.

    1.2.2人绒毛膜滋养细胞的HE染色待细胞在盖玻片上附壁伸展生长后，PBS冲洗两遍，用950 mL/L乙醇固定细胞3 h，苏木素染色3 min，自来水冲洗，5 mL/L盐酸酒精分色，自来水冲洗，伊红染色1  min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片，光镜观察.

    1.2.3人绒毛膜滋养细胞的免疫组化染色对细胞爬片进行抗角蛋白?7 IgG及波形蛋白IgG的免疫细胞化学染色，按操作步骤进行. 胞浆内有棕黄色颗粒者判定为阳性

    1.2.4原代培养的滋养层细胞的HBV感染将生长对数期的原代滋养层细胞消化传代，以2×105 /mL接种于3个50 mL培养瓶，当细胞培养生长至培养瓶底的70%时，弃去原培养液，用无血清的DMEM洗涤细胞两次，加4 mL经DMEM稀释的HBV阳性血清(3×107拷贝/mL)感染细胞，分别加4 mL经DMEM稀释的HBV阴性血清及4 mL FBS DMEM作为阴性对照及空白对照. 37℃  50 mL/L CO2中孵育48 h后，经胰酶消化后用0.01 mol/L PBS清洗细胞5次，并收集第5次洗液，重新接种细胞以10 g/L FBS DMEM  4 mL继续培养，于12, 24和48 h分别收集细胞培养上清，分别应用ELISA法及PCR法检测HBsAg.  48 h后收集感染细胞检测HBV  DNA及cccDNA. 以1×105个/mL接种6孔板(预先放置经处理的盖玻片)，6孔板亦如上设组，每两孔为一组，分别加入含不同血清的培养液2 mL，48 h后收集6孔板中细胞爬片进行HBsAg的免疫组化.

    1.2.5感染后检测细胞上清HBsAg检测按ELISA操作说明进行；细胞免疫组化染色按常规进行；细胞中HBVDNA采用套式PCR方法，引物设计在HBV的S基因保守序列，扩增产物长度分别为416 bp, 206 bp. cccDNA检测［4］的方法. 扩增产物长度分别为1149 bp，426 bp. 每次试验均设阳性，阴性及空白对照.

    2结果

    2.1细胞形态学滋养细胞多呈上皮样细胞生长，形态多样，多数为方形或类圆形，细胞伸出较多伪足，胞浆丰富，胞核大，呈圆形，有多核细胞（图1）. 滋养细胞的免疫组化鉴定可见滋养层细胞角蛋白?7染色阳性波形蛋白染色阴性（图2）.

    2.2HBV体外感染后的检测ELISA检测培养上清HBsAg结果显示感染后48 h时细胞可检测到HBsAg，其他时点、空白对照组及阴性对照组细胞上清中均未检测到HBsAg. HBV感染对滋养层细胞形态和细胞生长的影响：原代培养滋养层细胞在与HBV阳性血清共同孵育后均未出现明显的细胞病变，细胞继续生长，与阴性对照组相比无明显差异(图3). 感染后24和48 h在滋养层细胞细胞浆可见HBsAg的阳性表达. HBsAg位于胞膜和/或胞质，染色较浅，阳性细胞数<300，呈弱阳性，各时间点之间染色强度差异不显著(图4). 图1胎盘滋养细胞HE ×100

    2.3PCR检测细胞培养上清和细胞中的HBV DNA感染后48 h后，提取感染后细胞DNA后进行特异性HBV DNA和HBV cccDNA的PCR扩增， 第2轮PCR扩增时可见较淡的HBVDANA条带，未显示出HBV cccDNA的特异性条带(图5).

    3讨论

    胎盘是母体与胎儿之间的桥梁，是物质交换的场A： HBV阳性血清感染组；B： 阴性对照组.所，由绒毛滋养层、绒毛内薄层结缔组织、和绒毛内毛细血管内皮形成的连续物理屏障－胎盘屏障，具有选择性通透作用，避免了母胎之间免疫活性细胞的直接接触，对病原微生物也有一定的阻挡作用. 但这种屏障功能并不完善，胎盘本身能遭受感染，通透性增加，各种病毒比较容易通过胎盘感染胎儿. 胎盘不仅是一个物理屏障，也构成了HBV宫内感染胎儿的通道［5-6］. 岳亚飞等［7］的研究提示HBsAg和HBeAg主要位于受感染胎盘组织的细胞浆内，而HBcAg和HBVDNA主要位于细胞核内，从而提示HBV可进入胎盘的细胞内，并可能在其中复制和表达. 免疫病理研究显示HBV可感染胎盘组织中的各类细胞，但HBV是否在这些细胞中复制，以及HBV在胎盘不同细胞间是怎样传递的，哪些因素促进或阻止了感染的发生，很多问题还不清楚. “细胞转移”的过程这一假设是建立在对HBsAg阳性孕妇娩出胎盘各层细胞的免疫组化与原位杂交检测结果的基础上，尚没有在体外实验系统中得到验证. 如果要全面系统地观察HBV在胎盘细胞中的转移过程，验证组织标本中的结果，必须要在体外实验系统中进行研究. 由于目前缺乏合适的HBV宫内传播的动物模型，故细胞模型是比较理想的体外研究工具.

    　　胎盘屏障的第一层细胞是滋养层细胞，该层细胞直接与母亲血液接触，因此，母血中的HBV只有首先成功穿越滋养层细胞并最终到达胎儿血循环，才有可能感染胎儿［8］. 然而，滋养层细胞不是HBV的靶细胞，因此滋养层细胞到底能否被HBV感染，依然是有争议的. Wang等［9］应用滋养细胞来源的人绒毛膜癌JEGⅢ细胞的研究结果表明，HBV体外可以感染培养的滋养层细胞，生理量的TNF?α的存在，可以更好地模拟孕期体内滋养层细胞生存微环境，对其感染有促进作用. 建立在滋养层细胞来源的肿瘤细胞系中的研究固然方便，但在其实验结果的解释上及其适用性方面逊于原代培养细胞. 本研究通过对早孕胎盘绒毛滋养层细胞进行分离、纯化和培养传代，获得较高纯度的滋养层细胞，为研究HBV经胎盘感染形成宫内传播的机制提供细胞学体外感染模型.

    　　为了证实HBV对滋养层细胞的感染，我们对培养的原代滋养层细胞进行了HBV的体外感染实验. 我们将HBV感染者血清与原代培养的滋养细胞共同孵育，模拟了在体内滋养层细胞浸浴在母体血液中的情况，发现加入感染血清后滋养层细胞的生长速度与对照组无明显差别，未出现明显的细胞病变，也未见凋亡细胞明显增多，提示乙型肝炎病毒对体外培养的滋养层细胞无明显的致细胞病变作用. 为了进一步证实人滋养层细胞对HBV的易感性，我们通过细胞免疫组织化学染色法和ELISA检测乙型肝炎病毒对滋养层细胞的感染情况，结果发现： ①   HBV感染48 h的原代滋养层细胞分泌的上清中可检测到HBsAg的表达，HBsAg阳性细胞（胞浆中含棕黄色颗粒）在滋养层细胞中呈散在分布，且数量较少；② 感染率并不随感染时间的延长而有所差异3；③ PCR检测结果显示，PCR扩增各时间点细胞标本HBV DNA后，电泳显示较弱的HBV DNA特异条带出现，未检测到cccDNA. 本研究结果显示HBV体外虽然可以感染人绒毛膜滋养层细胞，但感染效率较低，HBV可能不在滋养细胞中复制.

    　　本研究在检测HBV对滋养层细胞的感染时，仅检测了感染当代的细胞，而没有对感染细胞进行连续传代，没有研究细胞内合成的子病毒是否具有感染性. 从目前来看，滋养细胞可能对HBV的易感性不是很高. 但这是最初步的研究，很多方面都很粗略，仅仅将滋养细胞与HBV阳性血清共同孵育不能完全代表体内的真实情况. 此外，滋养细胞是有多种功能的细胞，HBV是以何种方式穿越滋养细胞屏障，感染后的滋养细胞功能、激素的分泌和细胞因子的产生有无变化，病毒是如何进行细胞间的传递的，均需要进一步深入研究.

【参考文献】
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［8］ Bhat P, Anderson DA. Hepatitis B virus translocates across a trophoblastic barrier［J］. J Virol, 2007,81(13):7200-7207.

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