siRNA沉默livin基因对恶性黑素瘤LiBr细胞凋亡、周期及增殖的影响

              作者：王昊，谭升顺，王新阳，刘栋华，于春水，白转丽   

【摘要】  　　目的： 观察沉默livin基因对恶性黑素瘤LiBr细胞凋亡和周期及增值的影响. 方法： 采用siRNA?3 转染人恶性黑素瘤LiBr细胞后分别应用TUNEL法和Annexin V?FITC/ PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响，应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变，应用免疫荧光细胞化学技术检测siRNA对凋亡效应蛋白Caspase?3表达的影响及应用MTT法检测siRNA对细胞增殖的作用. 结果： siRNA?3转染LiBr细胞72 h可诱导细胞凋亡(P<0.05)和引起细胞G0/G1期阻滞(P<0.05)；可下调Caspase?3蛋白表达(P<0.05)及抑制细胞增殖(P<0.05). 结论： Livin可做为应用RNA干扰技术探索恶性黑素瘤基因的潜在靶基因.

【关键词】  livin；黑色素瘤；RNA干扰；细胞凋亡；细胞周期；细胞增殖

　    【Abstract】 AIM:  To investigate whether silencing livin gene by small interfering RNA (siRNA)leads to induction of apoptosis, arrest of cell cycle and inhibition of proliferation in malignant melanoma LiBr cells.  METHODS: A chemically synthesized siRNA duplex  targeting to livin, which had been validated to be efficient  in downregulation of livin expression previously, was  transfected to human malignant melanoma LiBr cells. Then TUNEL assay  and Annexin V?FITC/ PI flow cytometric analysis were performed for apoptosis, PI flow cytometric analysis for cell cycle, immunofluorescence analysis for Caspase?3 protein expression, and MTT assay for cell proliferation. RESULTS: Silencing livin gene by siRNA could induce apoptosis (P<0.05) and upregulate caspase?3 obviously(P<0.05), arrest cell cycle at G0/G1 phase significantly(P<0.05), and inhibit cell proliferation remarkably(P<0.05). CONCLUSION: Livin can serve as a potential molecular target to malignant melanoma in gene therapy by siRNA.

    【Keywords】 livin;  melanoma; RNA interferenc; apoptosis; cell cycle; cell proliferation

　　 0引言

    恶性黑素瘤（malignant melanoma, MM）近年来在世界范围内的发病率明显上升, 因其高度恶性、易转移且对化学及放射疗法不敏感，致患者5 a生存率不到10％. livin是近年来发现的凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein, IAP）家族的最新成员，其在多数恶性肿瘤细胞中高表达而在正常细胞中不、或低表达的特点开始引起研究人员的关注［1］. RNA干扰（RNA interence, RNAi）现象的发现及小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)在哺乳动物细胞产生RNA干扰效应的技术建立为肿瘤基因治疗探索在方法上开辟了新的途径［2］. 我们以化学合成的siRNA?3序列沉默livin基因后观察其对恶性黑素瘤LiBr细胞凋亡、周期及增殖的影响，为探索恶性黑素瘤的基因治疗提供实验依据.

    1材料和方法

    1.1材料恶性黑素瘤细胞株LiBr由第四军医大学西京皮肤科高天文教授惠赠；DMEM培养基、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；siRNA –3为前期研究中从设计的靶向livin（GenBank Accession No. NM_022161）的3条序列中确定的敲低效应最佳的干扰序列（sense 5′?GAG AGG UCC AGU CUG AAA GdTdT?3′, antisense 5′?CUU UCA GAC UGG ACC UCU CdTdT?3′，与livin mRNA特异结合位点：790?808），siRNA?NC为与人类基因组序列无任何匹配的阴性对照序列（sense 5′?UUC UCC GAA CGU GUC ACG UdTdT?3′, antisense 5′?ACG UGA CAC GUU CGG AGA AdTdT?3′），由上海GenePharma公司化学合成并退火形成双链（siRNA duplexes）. LipofectamineTM 2000 转染试剂购自Invitrogen 公司；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒购自南京Keygen公司；Annexin V?FITC试剂盒购自深圳晶美公司.

    1.2方法将复苏的LiBr细胞置事先加含100 mL/L胎牛血清的高糖型DMEM细胞培养液的100 mm培养皿中，37℃  50 mL/L CO2 孵箱内培养. 常规更换培养液、传代. LiBr细胞株系半贴壁细胞，实验操作须动作轻柔，传代时不需胰酶消化，只需吹散即可. 实验用细胞均使之处于状态良好的对数生长期. 转染前1 d按不同试验要求将所需密度的细胞传代于相应规格的培养皿或培养板，24 h后,待细胞达到所需融合率时在无血清DMEM环境中转染. 转染操作按LipofectamineTM 2000试剂说明书进行.

    1．2．1TUNEL法检测细胞凋亡细胞以1.5×105/孔细胞密度接种于置入细胞爬片的6孔板中，待细胞会合率达到30％~50％时，以siRNA?3序列100 nmol/L浓度转染LiBr细胞，同时设Blank，Mock，siRNA?NC 3个对照组. 转染72 h后按TUNEL法检测. 操作按TUNEL试剂盒说明书并调整进行,依次进行40 g/L多聚甲醛固定30 min, 30 nmol/L双氧水甲醇溶液封闭10 min, 1 nmol/LTritonX?100通透处理15 min,TdT酶反应液50 μL 37℃湿润避光反应60 min, Streptavidin?HRP工作液50 μL 37℃湿润避光反应30 min, 50 μL DAB（DAB 工作液：5 μL 20×DAB＋1 μL 300 mL/L H2O2＋94 μL PBS,需新鲜配制） 室温显色反应10 min,封片. 每步骤之间均需要PBS漂洗1 min×3次.  以不含末端脱氧核酸转移酶的标记液替代TUNEL反应液设立阴性对照. 在光镜下观察细胞经标记和显色后的颜色反应及结合形态学变化确定凋亡细胞. 不同处理组爬片高倍境下均随机选5个视野，计数凋亡阳性细胞. 实验结果以凋亡指数表示. 凋亡指数（％）＝（凋亡阳性细胞数/该视野下总细胞数）×100％.

    1．2．2Annexin V?FITC/ PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率以7.5×104/孔细胞密度在12孔板上种板. 待细胞会合率达到30％～50％时以siRNA?3序列100 nmol/L浓度转染LiBr细胞，同时设Blank，Mock，siRNA?NC 3个对照组. 转染72 h后分别将培养孔内细胞吹散吸至离心管4℃ 1500 r/min 离心5 min，弃培养基，再分别用4℃ PBS 1 mL洗细胞2次，弃上清，1×Binding Buffer 重悬细胞并调整细胞浓度至1×109/L. 吸细胞混悬液100 μL至5 mL流式管中，加Annexin V?FITC 5 μL和20 g/L的PI 10 μL,充分混匀，室温避光孵育15 min，每管加入1×Binding Buffer 400 μL,轻微漩涡混匀，1 h 内上流式细胞仪（FACSCalibur，Becton Dickinson, USA）检测. 同时以不加Annexin V?FITC和PI的一管做为阴性对照. 用软件Cell Quest进行分析，左上象限（UL）Annexin V-/ PI+代表机械损伤细胞百分率，右上象限（UR）Annexin V+/ PI+代表晚期凋亡细胞和坏死细胞百分率，左下象限（LL）Annexin V-/ PI-代表正常细胞百分率，右下象限（LR）Annexin V+/ PI-代表早期凋亡细胞百分率. 

    1．2．3免疫荧光细胞化学检测caspase?3蛋白表达细胞转染72 h后取出爬片，经40 g/L多聚甲醛固定15 min, 1 nmol/L TritonX?100通透15 min及每个环节之间的PBS漂洗后置爬片于湿盒中，每片滴加1∶200稀释的Caspase?3一抗30 μL，其中一片加PBS 30 μL代替一抗做为荧光阴性对照，37℃孵育1 h. PBS漂洗30 s×3次，每片滴加1∶100稀释的FITC标记的二抗30 μL，37℃避光湿润孵育30 min. PBS漂洗30 s×3次，滤纸吸去多余液体，置载玻片上，滴加甘油封片剂10 μL封片. 荧光显微镜下观察,用软件Image Pro Plus进行荧光强度分析.

    1．2．4 PI单染流式细胞仪检测细胞周期细胞重悬细胞于4℃含30 g/L BSA的700 mL/L乙醇中，4℃固定24 h，1500 r/min离心5 min，弃上清. 再分别2次4℃ PBS洗细胞、1500 r/min离心5 min、弃上清. 加50 mg/L的RNase 1 mL,室温避光30 min. 1500 r/min离心5 min、弃上清，加入60 mg/L的PI  1 mL, 室温避光30 min后上流式细胞仪（FACSCalibur，Becton Dickinson, USA）检测细胞周期. 实验结果用随机所带软件ModFitLT分析.

    1．2．5MTT检测LiBr细胞增殖细胞以5×103/孔细胞密度接种于96 孔板中，共4块板. 待细胞会合率达到30％～50％时，以siRNA?3序列100 nmol/L浓度转染LiBr细胞，同时设Blank, Mock, siRNA?NC 3个对照组和只加培养基的调零组，每组各设5个复孔，每孔培养体积为180 μL；在转染后24, 48, 72和96 h时加入5 g/L的MTT 20 μL，继续培养4 h后小心吸出孔内培养液，每孔加入DMSO 150 μL,微型振荡器上低速振荡10 min,在酶联免疫检测仪上检测各孔A值,检测波长490 nm. 不同时间点依次检测. 实验结果取每组5个复孔的平均值. 细胞增殖抑制率（％）＝（1-实验组A值/空白对照组A值）×100％. 绘制细胞生长曲线. 

    统计学处理： 每项实验独立进行3次，所得数据以x±s表示, 多组间均数比较用单因素方差分析及多重比较；P<0.05为差异具有统计学意义.

　　 2结果

    2.1LiBr细胞凋亡siRNA?3可明显诱导LiBr细胞凋亡，凋亡指数达(16.0 ± 2.6)%（P<0.05 vs Blank, Mock, siRNA?NC 3个组）. 相反，Blank, Mock, siRNA?NC组凋亡指数分别为(6.2±1.1)%, (6.5±1.5)% 和(7.0±1.1)%（图 1）. siRNA?3可诱导LiBr细胞的早、晚期凋亡率分别为(28.7±5.6)%和(12.9±3.8)%（P<0.05 vs Blank, Mock, siRNA?NC 3个组）. Blank, Mock, siRNA?NC 3组早、晚期凋亡率分别为(4.9±2.0)%和(5.00±0.9)%；(5.8±1.4)%和(7.2±1.8)%；(7.0±1.6)%和(7.6±1.1)%.

    A: 空白对照组(Blank); B: 脂质体对照组(Mock); C: 阴性对照组(siRNA?3); D: siRNA?3.

    图1siRNA?3转染LiBr细胞诱导细胞凋亡

    2.2LiBr细胞caspase?3蛋白的表达siRNA?3作用的LiBr细胞胞质内可见明显绿色荧光，而Blank，Mock和siRNA?NC作用的LiBr细胞观察不到或仅有极微弱的绿色荧光(图2). 荧光强度定量显示，siRNA?3作用的LiBr细胞荧光强度为27.21±3.16，与Blank相比，差异具有统计学意义（P<0.05）. 而Blank， Mock和siRNA?NC 3组的细胞荧光强度分别是7.24±1.09, 8.04±1.86和7.96±1.45，彼此间差异无统计学意义（P>0.05）.

    2.3LiBr细胞周期siRNA?3作用的LiBr细胞G0/G1期为(69.4±4.4)％,S期为(18.6 ±2.7)% (P<0.05)，与Blank组相比，G0/G1期升高而S期下降(P<0.05). 相反，与Blank组相比，Mock和siRNA?NC组作用后的LiBr细胞周期差异无统计学意义（P>0.05，图 3）.

    2.4LiBr细胞增值细胞增殖曲线显示，与Blank组相比，siRNA?3作用后的LiBr细胞其增殖速度在上述时间范围内明显降低（P<0.05），其中，在72 h时对LiBr细胞的增殖抑制率最高，可达(33.4±3.5)% (P<0.05 vs 24 h, 48 h, 和 96 h ) ，96 h时细胞增殖速度加快，抑制率有所下降. 相反，与Blank组相比，Mock和siRNA?NC组作用后的LiBr细胞增殖抑制率差异无统计学意义（P>0.05，图 4）.

     3讨论

    凋亡抑制与肿瘤的发生与转移密切相关 . 以凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein, IAP）作为靶点成为新的基因研究策略［3］.  本研究显示，靶向livin的siRNA双链可诱导恶性黑素瘤LiBr细胞凋亡. livin 基因只含一个BIR结构域并通过抑制Caspase?3, 7, 9 的活性实现抑制细胞凋亡［4］. 凋亡通路下游的效应分子Caspase?3是线粒体和死亡受体两条凋亡信号途径的共同通道，凋亡通路一旦激活则引起Caspase?3级联反应并使其活化引起细胞凋亡. 免疫荧光细胞化学检测表明，siRNA?3转染后LiBr细胞Caspase?3表达明显升高，这提示沉默livin后Caspase?3活性释放，激活凋亡通路，促进了细胞凋亡［5］.

    　　本研究证实了靶向livin基因沉默后导致LiBr细胞周期出现G0/G1期阻滞和细胞增殖抑制. 细胞周期调控异常是恶性肿瘤细胞凋亡和增殖异常的重要原因［6］. 本研究结果显示，LiBr细胞被转染siRNA?3后进入G0/G1期的细胞明显增多，进入S期的细胞明显减少，表明靶向livin的siRNA转染LiBr细胞后恶性增殖信号受到抑制，细胞增值周期进展受阻，细胞增殖能力下降，从而促进细胞凋亡进程. MTT检测也标明转染后LiBr细胞增殖明显受到抑制，在转染后72 h细胞增值抑制率最高. 由此推测，livin的表达可能具有周期依赖性. 我们的研究初步证实了采用RNA干扰技术靶向livin可诱导恶性黑素瘤LiBr细胞凋亡、引起细胞周期阻滞和抑制细胞增殖. 但化学合成的siRNA系瞬时转染，干扰效应维持时间较短，以后可构建表达产生siRNA?3序列的真核表达载体以期较长期、稳定产生livin基因的沉默效应［7］. 该体外研究结果为靶向livin基因的恶性黑素瘤的基因治疗提供了实验依据. 

【参考】
  ［1］ Liu B, Han M, Wen JK, et al. Livin/ML?IAP as a new target for cancer treatment［J］. Cancer Lett, 2007, 250(2):168-176.

［2］ Izquierdo M. Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy［J］. Cancer Gene Ther, 2005,12(3):217-227.

［3］ Nachmias B, Ashhab Y, Ben?Yehuda D. The inhibitor of apoptosis protein family (IAPs): An emerging therapeutic target in cancer［J］. Semin Cancer Biol, 2004, 14(4):231-243.

［4］ Chang H, Schimmer AD. Livin/melanoma inhibitor of apoptosis protein as a potential therapeutic target for the treatment of malignancy［J］. Mol Cancer Ther, 2007, 6(1):24-30.

［5］ Crnkovic?Mertens I, Hoppe?Seyler F, Butz K. Induction of apoptosis in tumor cells by siRNA?mediated silencing of the livin/ML?IAP/KIAP gene［J］. Oncogene, 2003,22(51):8330-8336.

［6］ Pietenpol JA , Stewart ZA. Cell cycle checkpoint signaling: Cell cycle arrest versus apoptosis［J］. Toxicology, 2002,27(1812182):475-481.

［7］ Kasof GM, Gomes BC. Livin, a novel inhibitor of apoptosis protein family member［J］. J Biol Chem, 2001, 276(5):3238-3246.