肝癌患者手术前后外周血AFP mRNA定量检测的临床意义

【摘要】  目的: 研究肝细胞肝癌患者手术前后外周血AFP mRNA表达量的变化，分析其作为微转移标记物的可行性及与复发转移的关系. 方法: 使用实时荧光定量RT－PCR检测64例肝细胞癌患者手术前后外周血AFP mRNA表达量, 并进行平均6 mo以上的随访；同时以8例肝硬化患者、4例肝增生患者、8例肝血管瘤患者和10例健康志愿者作为对照组，对比检测其外周血单核细胞AFP mRNA的表达量. 结果: 复发34例. HCC组的术前AFP mRNA表达量明显高于对照组.术前外周血AFP mRNA 相对HCC的灵敏度为85.9%，特异性为90.3%，准确率为87.4%. HCC患者术后外周血AFP mRNA表达量明显高于术前.HCC组外周血术前、术后AFP mRNA水平表达量与术后复发转移有明显相关性，与TNM分期、血管癌栓或侵犯有相关性，但与术时肿瘤数目、癌细胞分化程度、包膜完整性均与血清AFP浓度无相关.术后HCC组外周血AFP mRNA表达量与肿瘤大小有相关性. 结论: 实时荧光定量RT?PCR法检测HCC患者外周血AFP mRNA表达量有很高的敏感性和特异性，可以反映HCC患者血中是否存在肝癌细胞.手术可促进部分HCC细胞脱落入血.监测外周血AFP mRNA水平对术后早期复发转移有预测价值.

【关键词】  癌 肝细胞 甲胎蛋白 RNA 信使 逆转录聚合酶链反应 肿瘤转移

    0引言

    肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC) 是我国常见的恶性肿瘤之一, 根治性切除术是其最有效的选择，但术后易复发，血源性播散是HCC复发转移的主要途径，因此早期发现外周血中微转移对于HCC的临床治疗和预后评估具有重要意义.甲胎蛋白(alpha?fetoprotein, AFP)mRNA是HCC微转移检测常用的标志物［1］, 但是其应用价值存在争议［2］，故本研究应用实时荧光定量RT?PCR技术检测HCC患者手术前后、对照肝病患者和健康志愿者外周血的AFP mRNA，分析AFP mRNA可否作为循环HCC癌细胞标志物，手术操作对HCC微转移的影响，以及与术后复发转移的关系.

    1对象和方法

     1.1对象前瞻性分析西南肝胆外科研究所自2005?09/2006?08初次入院治疗的HCC患者64（男57, 女7）例, 年龄25~69(46.0±10.6)岁，均行影像学(B超、CT和DSA)及血清甲胎蛋白(AFP)检测, 并经术后病理证实为肝细胞癌患者，其中I期34例，II期患者16例, III期11例, Ⅳ期3例.血清AFP＞20 μg/L者47例.HCC患者术前肝脏储备功能评估：15 min吲哚靛青绿储留率(ICGR?15)均＜15%（平均5.5%）；Child?Pugh 评分A级60例，B级4例.所有手术均为开腹手术，其中行解剖性切除术27例，行非解剖性切除术37例.术后平均随访6 mo以上.对照组患者:肝硬化8例；肝脏增生4例，肝脏血管瘤8例，正常对照10例. 人淋巴细胞分离液由天津中科院生研所灏洋生物制造；RNA 提取试剂盒RNAiso Reagent和实时荧光定量RT?PCR 试剂盒（SYBR? Premix Ex TaqTM, Perfect Real Time）均为宝生物工程（大连）有限公司产品.Beckman CS?15R高速冷冻离心机为美国Beckman公司产品；PCR system 2700型PCR仪为美国PE公司产品；LightcyclerⅡ荧光定量PCR仪为德国Roche公司产品.

    1.2方法

    1.2.1外周血标本HCC组患者分别在手术切皮前及关腹后从深静脉置管内抽取静脉血5 mL，肝硬化组、肝脏增生组、肝血管瘤组患者也术前从深静脉置管内抽取静脉血5 mL，健康志愿者抽取肘静脉血5 mL，均肝素抗凝后，用人淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞.分离的单核细胞－80℃冰箱保存，待统一提取RNA.AFP表达阳性对照细胞系HepG2细胞株由本所实验室保存提供.

    1.2.2总RNA的提取及测定按照宝生物公司的RNA提取试剂盒RNAiso Reagent进行.用紫外分光光度仪测量OD 260/280比值并评估RNA的纯度，根据OD 260/280比值总RNA的含量.RNA的完整性用10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示.

    1.2.3引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，所用引物，AFP mRNA引物序列如下：正义链：5?TCA GTG AGG ACA AAC TAT TGG?3，反义链：5?CTC TTC AGC AAA GCA GAC TTC?3；β?actin正义链：5?AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT?3，反义链：5?GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT?3.

    1.2.4反转录反应合成cDNA① 按照宝生物公司的实时荧光定量RT?PCR 试剂盒进行，反应液体配制在冰上进行.我们采用20 uL的反应体系(包括1000 ng总RNA). ② 在PCR system 2700型PCR仪上设置反转录条件：37℃ 15 min→85℃ 5 s→4℃保存. ③完成反转录操作，cDNA 产物-20℃冻存备用.

    1.2.5Real time PCR 反应按照宝生物公司的实时荧光定量RT?PCR 试剂盒进行，所有操作均在冰上进行，用LightcyclerⅡ荧光定量PCR仪检测.PCR 扩增反应条件设置如下：预变性95℃ 10 s，1个循环；PCR反应：95℃ 变性5 s，57℃ 退火 20 s，72℃延伸15 s，共40个循环.每次同时制作标准曲线并测定阳性对照和阴性对照.β?action退火温度是59℃，其余反应条件相同.基因表达量＝ct目的基因/ct β?action.

    统计学处理：数据应用SPSS13.0软件包进行统计分析.数据以x±s表示或以中位数结合范围表示.组间均数比较采用TamhaneT2检验.相关分析检验用Spearman法. P<0.05为显著性差异.

    2结果

    2.1敏感性实验将5.72×107/L HepG2细胞等倍稀释到5.72×103/L，加入5 mL正常健康人血中混匀，按照上述方法分离正常人血单核细胞后提取总RNA，做PCR扩增.结果在5 mL全血中有5个癌细胞即可被检出，说明实时荧光定量RT?PCR检测外周血微转移癌细胞的敏感性可以达到1/106~107.

    2.2HCC组与对照组血AFP mRNA表达HCC组的AFP mRNA相对表达量明显高于其他四组，差异有统计学意义，其余各组之间无统计学差异（P＜0.05, 表1）. 术前外周血AFP mRNA相对HCC的灵敏度为85.9%，特异性为90.3%，准确率为 87.4%.必须提出的是肝硬化中的3例患者AFP mRNA的表达是阳性.

    表1HCC与对照组AFP mRNA表达量 组别〖〗n〖〗AFP mRNA表达量（×104） HCC〖〗64〖〗8.255(0.009~6520.0)a肝硬化〖〗８〖〗0.088(0.006~0.219)肝脏增生〖〗４〖〗0.009(0.005~2.260)肝脏血管瘤〖〗8〖〗0.0422(0.004~0.320)正常对照〖〗10 〖〗0.069(0.001~0.581)aP＜0.05 vs 其他各组.

    2.3HCC组手术前后血AFP mRNA表达术前外周静脉血的阳性率为85.9%，术后外周静脉血的阳性率为89.1%，手术前后外周血的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)；术前外周血AFP mRNA相对表达量的中位数为8.3×10-4(9.0×10-7~6.5×10-1), 术后外周血AFP mRNA相对表达量的中位数为2.6×10-3(8.0×10-7~6.9×10-1)，二者比较有极显著差异(P=0.002).

    2.4HCC组血AFP mRNA表达量与临床病特征及术后复发HCC组外周血术前、术后AFP mRNA水平表达量与术时肿瘤数目、包膜完整性、癌细胞分化程度与血清AFP浓度无相关性；与TNM分期有相关性，术前相关系数为0.367 (P=0.003)；术后相关系数是0.459(P=0.000)；与血管癌栓或侵犯有相关性, 术前相关系数是0.358(P=0.004)；术后相关系数是0.447(P=0.000). 随访至2007?04，AFP mRNA表达量与术后早期复发者有明显相关性，相关系数分别是术前0.357(P=0.004)，术后0.524(P=0.000).值得提出的是术前外周血AFP mRNA表达量与肿瘤大小无相关性，而术后则有相关性:相关系数是0.299(P=0.016). 随访期间复发34例，其中在残肝复发18例，对侧肝脏复发9例，肝外转移 7 例.

    3讨论

    血清AFP是诊断HCC重要的蛋白水平肿瘤标志物，其阳性率为70％.当肝癌发生时，由于低甲基化作用使AFP基因重新开放表达AFP，其表现型为血清AFP阳性肝细胞癌［3］；当AFP基因表达调控停止在转录后翻译前，则表现为血清AFP阴性HCC，如果检测AFP基因表达的第一步即mRNA，则对部分AFP阴性肝细胞癌也可作出诊断.

    实时荧光定量RT?PCR技术具有高效性、高特异性、高敏感性及计量准确的特点，较普通RT?PCR敏感性更高, 其检测敏感性可以达到107个正常细胞中检出1个癌细胞的水平［4］，因此成为目前微转移检测的理想工具.本研究显示5 mL全血中检出5个癌细胞，敏感性与之相当. 我们的研究发现HCC患者术后外周血AFP mRNA表达量明显高于术前，差异有统计学意义，说明手术操作本身因挤压肿瘤可以促进癌细胞的从肝脏向外周血的转移，更加有意义的是术前外周血AFP mRNA水平相对表达量与肿瘤大小无相关性，而术后HCC组外周血AFP mRNA水平相对表达量与肿瘤大小有相关性（r=0.299, P=0.016），说明肿瘤直径越大，手术操作更容易挤压引起癌细胞向外周血转移，引起术后早期复发和肝外转移.此发现提醒术者切除肝癌时要坚持无瘤原则，动作轻柔，尽量减少触摸、挤压肿瘤.

    AFP mRNA是目前认为比较有价值的循环HCC细胞标志物，但也存在争议［1-2, 4］，可能与所采用PCR方法和所选择病例不同有关.本研究表明术前外周血AFP mRNA 相对HCC的灵敏度为85.9%，特异性为90.3%，准确率为 87.4%，表明术前AFP mRNA表达量可以用于HCC的诊断.本研究发现HCC组的术前AFP mRNA表达量明显高于对照肝病组患者；健康志愿者和肝脏血管瘤患者均无AFP mRNA表达，而3例肝硬化和一例肝增生患者AFP mRNA的表达均是阳性，虽然其AFP mRNA相对表达量很低，这说明AFP mRNA并不是HCC细胞特异性的，而是肝细胞特异性的，或者是体内已经有癌变细胞但无癌肿块表现出来，因此单纯定性不能区分良、恶性肝细胞，定量法更有实用价值.我们研究提示实时荧光RT?PCR 技术应用于定量检测血液AFP mRNA，结果表明该方法灵敏、简便、精确、重现性好，很有临床应用前景.

    既往Witzigmann 等［5］认为外周血AFP mRNA的阳性率与TNM分期、血清AFP水平、肝内转移、门静脉癌栓以及远处转移均无关，但更多的研究提示外周血AFP mRNA的阳性率与肿瘤病理和复发转移相关［1, 4］.本研究中，HCC组外周血术前、术后AFP mRNA水平相对表达量与TNM分期、血管癌栓或侵犯相关性有明显统计学意义，TNM分期越高，AFP mRNA表达量就越高.血管癌栓或侵犯的患者AFP mRNA相对表达量也高于无血管癌栓或侵犯，此结果提示如有血管癌栓或血管侵犯后，HCC细胞脱落入血的机会增加，此种情况下HCC是否就是一种全身性疾病？值得进一步研究.本研究也发现HCC组外周血术前后AFP mRNA水平相对表达量与术后早期复发者相关性有明显统计学意义，相关系数分别是术前0.357和术后0.524，特别是术后AFP mRNA相对表达量与复发者高度相关，相关系数是0.524，说明术后外周血的AFP mRNA相对表达量可以作为HCC术后复发的很好的预测指标.Minata等［6］报道, 术后外周血检AFP mRNA可以提前1~12 mo预警肝癌复发，因此对同一患者进行连续动态监测可能更具有临床意义，同时也提示监测外周血AFP mRNA变化用于慢性活动性肝炎和肝硬化恶变的早期发现也很有临床意义. 

【】
  ［1］ Ijichi M, Takayama T, Matsumura M, et al Alpha?fetoprotein mRNA in the circulation as a predictor of postsurgical recurrence of hepatocellular carcinoma: A prospective study ［J］. Hepatology, 2002, 35(4):853-860.

［2］ Kedda MA，Kew MC, Skelton M, et a1 Non?specificity of messenger RNA of alpha?fetoprotein in periphera1 blood in detecting early spread of hepatocellular carcinoma in black Africans［J］. J Gastroentero1 Hepatol，1998, 13(9):885-891.

［3］ Sell S, Longley MA, Boulter J. Lack of correlation of methylation and alphafetoprotein and albumin gene expression during liver growth, in hepatocellular carcinomas, and during hepatocarcinogenesis［J］. Tumour Biol, 1985，6(2):133-143.

［4］ Kamiyama T, Takahashi M, Nakagawa T, etal.AFP mRNA detected in bone marrow by real?time quantitative RT?PCR analysis predicts survival and recurrence after curative hepatectomy for hepatocellular carcinoma［J］. Ann Surg, 2006, 244(3):451-463.

［5］ Witzigmann H, Geissler F, Benedix F，et a1. Prospective evaluation of circulating hepatocytes by alpha?fetoprotein messenger RNA in patients with hepatocellular carcinoma［J］.Surgery, 2002, 131(1):34-43.

［6］ Minata M, Nishida N, Komeda T, et al. Postoperative detection of alpha fetoprotein mRNA in blood as a predictor for metastatic recurrence of hepatocellular carcinoma［J］. J Gastroenterol Hepatol, 2001, 16(4):445-451.