HPLC法测定生首乌和制首乌中大黄素的含量
【摘要】 建立生首乌和制首乌中大黄素含量的测定方法。［方法］采用HPLC法，SPHERISORB ODS2（150×4.6mm，5μm）色谱柱，流动相为甲醇-0.1%磷酸（85：15），检测波长为254nm，柱温28℃，流速1.0ml·min-1。［结果］回归方程为Y=3352.3X+37.297，线性范围为0.03～0.20μg。生首乌的平均回收率分别为96.6%（RSD=1.3%）。［结论］本方法准确灵敏，重复性好，可用于何首乌药材的质量控制。
【关键词】 何首乌 大黄素 HPLC
HPLC Measure the Content of Emodin in Raw and Prepared Fleece?flower Root
Abstract：［Objective］Make measurement of emodin content in raw and prepared fleece?flower root.［Method］Take HPLC and the color?spectrum column SPHERISORB ODS2（150×4.6mm，5μm），the flow spectrum being methanol –0.1% phosphate（85：15），the measurement wave length：254nm，column temperature：28℃，flow speed：1.0 ml·in-1.［Result］The regression equation Y=3352.3X+37.297，the linear range：0.03～0.20μg，the average reception rate of the raw fleece?flower root：96.6%（RSD=1.3%）.［Conclusion］The said method is correct and quick，with good repeat，can be used for quality control of fleece?flower root drug.
Key words：fleece?flower root；emodin；HPLC
何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）为蓼科植物何首乌的块根，中药理论认为，其生用具有解毒、消痈、润肠通便的功效，多用于瘰疬、疮痈、风疹瘙痒、肠燥便秘、高血脂等症；制首乌具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨等功效，多用于血虚萎黄、眩晕耳鸣、须发早白、腰膝酸软、肢体麻木、崩漏带下、高血脂等症［1］。生、制何首乌的临床功效之所以不同，是由于药材经过炮制后所含成分发生变化而造成的。据报道，何首乌药材在炮制的过程中以大黄素为代表的蒽醌类含量会随着炮制时间的延长而减少［2］。本文采用HPLC法测定生首乌和制首乌药材中大黄素的含量，为其生制两用的原因及药材的质量控制提供一定的依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Waters 510高效液相色谱仪；Waters 484 Tunoble Absorbance Detector检测器；EastChrom G02色谱工作站软件；KQ-5200型超声波清洗器（200W，40kHz，昆山市超声仪器有限公司）；METTER TOLEDO AG135天平；BS110S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。
1.2 试剂与药材 甲醇为色谱纯，水为纯化水，其它试剂均为分析纯。大黄素对照品由药品生物制品检定所提供（批号：110756-200110），生首乌和制首乌均购自亳州市永刚饮片厂并经鉴定为(Polygonum multiflorum Thunb.)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：SPHERISORB ODS2（150×4.6mm，5μm），流动相：甲醇-0.1%磷酸（85∶15），检测波长为254nm，柱温28℃，流速1.0ml·min-1。在此色谱条件下，供试品色谱与对照品色谱在相同的保留时间处有相应色谱峰，与其它组分能基本达到基线分离，理论塔板数以大黄素峰计不小于3000。
2.2 溶液的制备 (1)对照品溶液的制备 精密称量大黄素对照品3.0mg，置25ml量瓶中，加甲醇定容后，摇匀，即得浓度为0.12mg·ml-1的对照品溶液。(2)供试品溶液的制备［3］1)生首乌，药材经粉碎后过60目筛并干燥至恒重。精密称取药材粉末0.2g，精密加甲醇20ml，称定重量，加热回流60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，挥去甲醇，加8%盐酸溶液10ml，超声处理2min，再加氯仿10ml，加热回流60min，冷却，置分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液用氯仿提取3次，每次10ml，合并氯仿液，减压回收至干，用甲醇定容于10ml量瓶，微孔滤膜滤过，即得。2)制首乌，药材经粉碎后过60目筛并干燥至恒重。精密称定药材粉末0.5g，精密加甲醇30ml，称定重量，加热回流60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤10ml，其他操作同上，最后残渣加甲醇溶解，并定容于2ml量瓶，微孔滤膜滤过，即得。
2.3 标准曲线的制备 用微量移液器精密吸取对照品溶液适量，用甲醇稀释制备若干份，注入液相色谱仪10μl，以浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，进行线性回归，求得回归方程：Y=3352.3X+37.297，r=0.9995。结果表明大黄素在0.03～0.20μg范围内，呈良好的线性关系。
2.4 精密度试验 精密吸取对照品溶液，重复进样6次，每次10μl，结果RSD为0.84%（n=6）。
2.5 稳定性试验 取生首乌和制首乌供试品溶液10μl，分别于配制后0、2、6、12、24h后进样，按上述色谱条件测定，RSD分别为2.3%和2.7%，表明供试品溶液在24h内基本稳定。
2.6 重复性试验 取同一批号生首乌和制首乌药材各6份，按“2.2.2.1”项制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件，注入10μl，测定峰面积，并由回归方程生首乌和制首乌样品的含量，结果其RSD分别为0.89%和1.1%，表明此方法重复性良好。
2.7 加样回收试验 取已知含量的生首乌样品0.1g，精密加入对照品液2ml，按“2.1”色谱条件，依法测定，结果平均回收率分别为96.6%（RSD=1.3%）。
表1 回收率结果表（略）
2.8 大黄素的含量测定 精密称取各样品，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定生首乌和制首乌供试品溶液中大黄素含量。测定结果见表2，色谱图见图1。
表2 大黄素含量测定结果(n＝6)（略）
图1 高效液相色谱图（略）
A.制首乌 B.生首乌 C.对照品；1峰为大黄素峰
3 讨论
3.1 本文建立了HPLC法测定生首乌和制首乌中大黄素的含量，样品中大黄素峰与其他峰能达到基线分离，且精密度高，准确可靠，可为该药材的质量控制提供一定依据。
3.2 蒽醌类为何首乌药材的主要成分之一，其中大黄素含量最高。大黄素一般以游离型和结合型两种方式存在［4］，故测定酸水解后总游离大黄素的含量作为质量控制指标较为。
3.3 由实验结果可知，制首乌中大黄素的含量显著低于生首乌，这与报道的何首乌药材炮制前后蒽醌类成分会发生变化［5］相一致。生首乌与制首乌的功效不同可能与其中的大黄素含量差异密切相关，大黄素可视为生首乌药效作用的指标性成分。
【文献】
［1］ 中华人民共和国药典委员会.药典［S］.2005版.北京化学工艺出版社，2005：122?123.
［2］ 罗健，黎知林，李娟，等.TLC法测定何首乌及其制品中大黄素的含量［J］.广东药学院学报，1997，13(3)：182.
［3］ 李义平，张胜春，杨广德.何首乌中大黄素的提取方法研究［J］.中成药，2004，26(4)：271?274.
［4］ 刘三康，钱广生，李章万.反相高效液相色谱法测定制首乌及其4种中成药中大黄素的含量［J］.药物分析杂志，1998，18(6)：372.
［5］ 郭青，鲁静.高效液相色谱法测定何首乌及其炮制品中的蒽醌类成分的含量［J］.药物分析杂志，2000，20(5)：326.
