鹿石合剂对缺氧缺血脑损伤新生大鼠海马神经元超微结构的影响

             作者：金丽, 钟秀容, 陈莲云, 赵小贞  

【摘要】  目的 探讨中药鹿石合剂对缺氧缺血脑损伤新生大鼠海马CA1区神经元超微结构的影响。 方法 结扎右侧颈总动脉及缺氧2 h,建立缺氧缺血新生大鼠模型,以西药“洛斯宝”为阳性对照,鹿石合剂灌胃,分别以透射电镜和光镜尼氏染色观察海马CA1区神经元超微结构及尼氏小体的变化。 结果 大鼠海马CA1区神经元核膜不清晰,染色质边集,大部分线粒体膜损伤,线粒体肿胀、空泡变性,线粒体嵴断裂、模糊或消失,粗面内质网数量减少、排列紊乱;鹿石合剂高剂量组粗面内质网丰富,细胞器结构接近假手术组,尼氏小体呈块状或颗粒状,染色比假手术组浓密。 鹿石合剂高剂量组疗效优于“洛斯宝”组。 结论 鹿石合剂可改善缺氧缺血脑损伤大鼠海马CA1区神经元超微结构的变化。

【关键词】  补益药; 缺氧缺血,脑; 海马; 神经元; 显微镜检查,; 染色与标记; 疾病模型,动物

    ABSTRACT:  Objective  To explore the protective effect of Lushi misture on ultrastructure of hippocampus CA1 area neurons in hypoxic-ischemic brain-damage neonatal rats.  Methods  The model rats were made by ligating right arteria carotis communis and suffering hypoxia for 2 hours, which were perfused with Lushi misture, and foreign medicine “vasobral” as control.  The ultrastructure and Nissl's body changes of hippocampus CA1 area neurons were observed by transmission electron microscope and light microscope(Nissl's staining).  Results  In the hippocampus CA1 neurons of hypoxic-ischemic brain-damage model rats, nuclear membrane became fuzzy, chromatin margination, mitochondrion membrane swelled and injured, vacuolar degeneration and its cristae was broken, dimmed or disappeared; the amount of rough endoplasmic reticulum(RER) decreased and its arrangement confused.  The RER was abundant in high-dose group of Lushi misture, the cell organ's structure approached to sham operated group, and the Nissl's body became clumped or granulo-form, and dyeing was thick.  The effect of high-dose group of Lushi misture was better than that of “vasobral” group.  Conclusion  Lushi misture can improve the ultrastructure of hippocampus CA1 area neurons of hypoxic-ischemic brain-damage rats.
   
　　KEY WORDS:  reinforcing drugs; hypoxic-ischemia,brain; hippocampus; neuron; microscopy,electron; staining and labeling; disease model,animal

    围产期窒息所致缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephelopathy,HIE)为新生儿期危害最大的常见病之一,常引起新生儿死亡和其后神经系统的发育障碍。笔者从传统医学着手,以补肾益精、活血化浊通络为原则选方(鹿石合剂),观察缺氧缺血新生大鼠模型给药前后海马CA1区神经元超微结构改变,寻求缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain-damage,HIBD)有效防治措施。西药“洛斯宝”能选择性抑制局部由于α受体激活所致的缩血管效应,使细胞保持完整线粒体功能,提高ATP酶活性,扩张脏器组织微血管,使红细胞充盈,改善供血和供氧［1］ ,本研究中作为阳性对照药物。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  药物 

　　鹿石合剂(鹿角胶、石菖蒲、熟地黄、枸杞子、黄芪、丹参等)为山东中医药大学田代华教授经验方。生药材购自福建省医药集团,煎剂由福建省第二人民制剂室制备(每剂含生药120.5 g,自动煎药机煎成40 mL,煎液含生药约3 g/mL)。“洛斯宝”［麦角隐亭咖啡因口服液,法国凯希大药厂,批号G00381,成分:甲磺酸双氢麦角隐亭A(mesilate) 50 mg,无水咖啡因500 mg］,用时以2倍双蒸水稀释。

　　1.1.2  动物 

　　7 d龄Sprague-Dawley(SD)大鼠100只(10窝),无性别选择,体质量(12.4±0.5)g (12.0~14.0 g),由上海西普尔-必凯实验动物有限公司［许可证号:SCXK(沪)2003-0002］提供。提前1 d购买,适应性喂养1 d后,随机分为两组(光镜、电镜研究各1组),每组随机分为假手术组、模型组、洛斯宝组、鹿石合剂低剂量组、鹿石合剂高剂量组(各10只)。动物饲养在上海大学医学院附属新华医院实验动物中心清洁级屏障环境中,至35 d龄时进行光镜、电镜下脑病理形态学及超微结构研究。

　　1.1.3  主要仪器 

　　缺氧实验装置(包括缺氧箱、恒温槽、低浓度氧气源、出气水封瓶)由上海市儿科医学研究所陈惠金教授研制(国家专利局专利号:ZL98 2 24707.9)［2］45-46。电子秤(JA2003,上海天平仪器厂)。透射电子显微镜(Hu-12A,日本日立公司)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  造模 

　　7 d龄大鼠,称体质量,乙醚麻醉,分离右颈总动脉并永久结扎,随后放入37 ℃(水浴)低氧箱中,通入8%氧气+92%氮气(1 L/min)的混合气2 h后取出,返回母鼠身边继续哺乳喂养。假手术组仅颈部切口,分离右颈总动脉,不结扎,亦不缺氧［2］159-160,166。

　　1.2.2  给药 

　　造模后24 h,中、西药剂灌胃,用药量为成人剂量6.25倍。鹿石合剂高剂量组每日灌胃量自0.25 mL起,体质量每增加5 g加药0.05 mL。鹿石合剂高、低剂量用药比为2∶1。洛斯宝组每日灌胃量自0.075 mL起,体质量每增加5 g加药0.025 mL(用时以2倍双蒸水稀释)。假手术组、模型组每日以双蒸水灌胃,用量自0.25 mL起,体质量每增加5 g加量0.05 mL。各组给药每日1次,用药14 d,喂养至35 d龄。

　　1.2.3  光镜组织切片制备 

　　药物干预后35 d龄大鼠,同时用生理盐水和4 ℃的4%多聚甲醛(500 mL)经心脏快速灌注固定,继而掀开颅盖,迅速取脑,平外侧膝状体水平冠状位切取右侧脑组织(含海马CA1区),将其固定于10%福尔马林溶液6 h,固定后常规石蜡包埋,连续冠状切片,尼氏(Nissl)染色(甲苯胺蓝染色法),光镜组织形态学观察。

　　1.2.4  电镜样品制备 

　　药物干预后35 d龄大鼠,称体质量,10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL/kg),掀开颅盖,迅速向颅腔滴入4%多聚甲醛+3%戊二醛(0.1 mol/L,pH 7.4磷酸缓冲液配制)的固定液,立即冰面上取右侧海马CA1区(平外侧膝状体水平)1 mm×1 mm×2 mm脑组织,4 ℃条件下3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定2 h,1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾后固定1.5 h,70%乙醇饱和醋酸铀染液块染,酒精-丙酮梯度脱水,环氧树脂618包埋剂包埋。超薄切片80 nm,醋酸铀、枸橼酸铅各染色5 min,透射电镜观察海马CA1区神经元超微结构改变并摄像(由福建医科大学电镜室完成)。

　　1.3  统计学处理 

　　采用SPSS 13.0统计软件,所得数据以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),组间两两比较采用LSD法。

　　2  结  果

　　2.1  神经缺失症状评分及体格变化 

　　造模后半数悬挂右旋(含自发右旋),爬行时左后肢呈拖步,有的向右侧转圈,成追尾状。神经缺失症状评分(采用［3］的评分标准,双盲法进行评分,<2分者不在入选之列)。7 d龄时各组建模后(手术后、药物干预前)差别无统计学意义(P>0.05),证明造模成功,35 d龄时(手术后、药物干预后)除假手术组外,各组两两比较,差别均有统计学意义(P<0.01,表1)。表1  大鼠7 d龄及35 d龄时神经功能缺失症状评分（略）

　　各组7 d体质量差别无统计学意义(P>0.05,表2),鹿石合剂高剂量用药后,体格发育良好,35 d体质量接近假手术组(P>0.05)。35 d模型组、洛斯宝组及鹿石合剂低剂量组体质量差别无统计学意义(P>0.05),但3组均与鹿石合剂高剂量组及假手术组的差别有统计学意义(P<0.01,表2)。表2  大鼠7 d龄及35 d龄时体质量（略）

    鹿石合剂高剂量组生长过程中,毛发润泽,活动灵活,35 d断头，血色红、量多(用移液器收集,每只约2 mL,接近假手术组,明显多于洛斯宝组、鹿石合剂低剂量组(1.5 mL左右)及模型组(0.8 mL左右),血清(全血3 000 r/min离心)量多(每只约1.2 mL)质清,接近假手术组。肉眼观察毛发润泽度及活动灵活度,洛斯宝组略次于鹿石合剂高剂量组,鹿石合剂低剂量组又次于洛斯宝组,模型组最差。从体格发育上,初步认为鹿石合剂有效果。

　　2.2  海马神经元病理改变

　　2.2.1  光镜尼氏染色 

　　模型组海马CA1区锥体细胞层神经元尼氏小体减少,中、西药物干预可改善尼氏小体的缺失,且鹿石合剂高剂量组效果优于洛斯宝组,鹿石合剂低剂量组则低于洛斯宝组（图1）。

　　2.2.2  透射电镜 

　　模型组神经元病理改变明显;鹿石合剂高剂量组神经元病理改变明显改善,细胞器结构接近假手术组,疗效优于洛斯宝组,表明鹿石合剂可改善缺氧缺血脑损伤模型的海马CA1区神经元超微结构（图2）。

　　3  讨  论

　　3.1  动物模型的评价 

　　可靠的动物模型是研究HIE发生、机制及防治措施、疗效评价的关键。新生7 d龄大鼠脑与新生儿出生时脑处于同一个发育阶段,大鼠脑组织结构及血液供应与人相似,可用于模拟新生儿HIE的病变和用作缺氧缺血性模型［4］。新生大鼠做HIE模型时,因大脑固有的Willis环存在着椎动脉与颈内动脉的支,单纯的吸入低浓度氧及结扎一侧的颈总动脉不能形成典型的HIE病变,只有结扎一侧颈总动脉以后再吸入8%低浓度氧,才能形成明显的病变,本造模方法具有可行性［5］。

　　3.2  组方依据及鹿石合剂可能作用机制

　　3.2.1  组方依据及药研究 

　　祖国医学将新生儿HIE称为“呆病”(清·陈士铎《辨证录》)。《医方集解·补养之剂》曰:“人之精与志皆藏于肾,肾精不足则志气衰,不能上通于心,故迷惑善忘也” ［6］。本研究所设鹿石合剂(鹿角胶、石菖蒲、熟地黄、枸杞子、远志、丹参、黄芪等),即基于HIE的“本虚标实”(肾精不足,瘀浊相兼),作用机制为补肾益精,开窍益智,活血化浊通络,从根本上促进小儿神经系统的发育,适用于无明显“热象”的小儿神经系统损伤的各种证候。

    药理学研究证实,黄芪可以有效抑制未成熟脑缺氧缺血损伤后海马区神经细胞的凋亡,提高神经细胞存活率,同时黄芪能够明显改善未成熟脑缺氧缺血损伤后的学习记忆能力［7］。石菖蒲能促进正常小鼠学习记忆和记忆获得,对记忆障碍有改善作用［8］。石菖蒲挥发油尤其是β-细辛醚有抑制大鼠神经细胞凋亡的作用［9］。有报告远志皂苷是远志的有效成分,具有改善记忆、抗氧化、抗衰老、强心、降压及老年性痴呆的作用。有报告远志皂苷能够明显地提高基底核内注射Aβ1-40模型大鼠的学习记忆能力,提高脑内降低的M受体密度和ChAT活性,降低脑AchE活性,对Aβ引起的神经细胞凋亡有明显的保护作用［10］。远志提取物能够在学习的多个阶段改善学习记忆障碍模型小鼠的学习记忆功能［11］。丹参具有钙通道拮抗作用,并能降低血小板黏附能力,扩张血管,改善微循环［12］ 。鹿角胶有抗疲劳,提高机体免疫力的作用［13］。

　　3.2.2  鹿石合剂对缺氧缺血脑损伤的修复作用 
　
　　HIE造成中枢神经系统的损伤,主要表现为大脑皮质及海马等部位的神经细胞的损伤,尤其海马CA1区是脑组织中对缺氧缺血最敏感的区域［14］,可表现为神经细胞的水肿、变性、凋亡及坏死,故本实验选取从海马CA1区神经元超微结构变化角度揭示鹿石合剂作用机制。此外,为克服电镜取材的局限性,本研究还观测了尼氏小体的改变，目前普遍认为其早于神经元光镜水平组织形态改变,且可较为敏感地反映神经元损伤。尼氏小体即粗面内质网与核糖核蛋白体,本研究证明其变化趋向与透射电镜超微结构变化一致。

    本文缺氧缺血造模后,大鼠海马CA1区神经元有不同程度的变化,以线粒体、粗面内质网、核仁及高尔基体尤为显著。药物干预后,线粒体及粗面内质网增多,核仁及高尔基体发达(鹿石合剂高剂量组优于“洛斯宝”组),反映了细胞代谢旺盛,功能活跃,大量的能量储备为物质转运和蛋白质合成做准备,由此可得出结论，能量和蛋白质代谢障碍是缺氧缺血脑损伤(HIBD)的主要病理机制。鹿石合剂“补肾益精,活血化浊通络”,可从根本上促进细胞的代谢,使功能旺盛,损伤减轻,若能于造模前用药,当更能体现其神经保护作用。

    中药复方讲求整体观念,主要用天然药物治疗HIE,较之西药拥有“多靶点、多环节、多层次”的独特优势,综合疗效较好。鹿石合剂能否用于防治人类新生儿HIE,以及用药的最佳时窗与最佳剂量,鹿石合剂的毒副作用及远期效果,都有待今后深入研究与探讨。

    (致谢:本研究承蒙福建医科大学基础医学院电镜室吴翊钦高级实验师的悉心指导,谨致谢忱。)

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